Nietoperzowy koronawirus WIV1 z podobnym do ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koduje dodatkowe białko pomocnicze i gen ORFX, zaangażowane w modulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza

Oryginalny tytuł: "Bat Severe Acute Respiratory Syndrome-Like Coronavirus WIV1 Encodes an Extra Accessory Protein, ORFX, Involved in Modulation of the Host Immune Response".

Autorzy: Lei-Ping Zeng a) Yu-Tao Gao a), Xing-Yi Ge a), Qian Zhang a), Cheng Peng a), Xing-Lou Yang a), Bing Tan a), Jing Chen a), Aleksei A. Chmura b), Peter Daszak b), Zheng-Li Shia a).

a) Key Laboratory of Special Pathogens, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.

b) EcoHealth Alliance, New York, New York, USA

Data publikacji: 11 maja 2016, "Journal of Virology".

[Wybrane przez autora bloga fragmenty pracy, patrz niżej UWAGI]

STRESZCZENIE

Nietoperze są nosicielami koronawirusów podobnych do ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS) (SL-CoV), od których - jak się uważa, wywodził się czynnik sprawczy pandemii SARS w latach 2002-2003. Jednak pomimo faktu, że u nietoperzy wykryto dużą liczbę genetycznie zróżnicowanych sekwencji SL-CoV, tylko dwa szczepy (nazwane WIV1 i WIV16) zostały z powodzeniem wyhodowane in vitro. Te dwa szczepy różnią się od SARS-CoV jedynie tym, że zawierają dodatkową otwartą ramkę odczytu (ORF), nazwaną ORFX, pomiędzy ORF6 i ORF7, która nie ma homologii z żadną ze znanych sekwencji białkowych.

W badaniu tym skonstruowaliśmy klon cDNA pełnej długości SL-CoV WIV1 (rWIV1), mutanta delecyjnego ORFX (rWIV1-λX) i mutanta eksprymującego zielone białko fluorescencyjne (GFP) (rWIV1-GFP-λX).

Hybrydyzacja techniką Northern i mikroskopia fluorescencyjna wskazują, że ORFX ulegał ekspresji podczas infekcji WIV1. Test infekcji wirusowej wykazał, że rWIV1-λX replikuje się równie wydajnie jak rWIV1 w komórkach Vero E6, Calu-3 i HeLa-hACE2. Dalsze badania wykazały, że ORFX może hamować produkcję interferonu i aktywować kompleks białkowy NF-κB. Nasze wyniki pokazują po raz pierwszy, że unikalny ORFX w szczepie WIV1 jest funkcjonalnym genem obejmującym modulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale nie jest niezbędny do replikacji wirusa in vitro.

ZNACZENIE

Nietoperze są nosicielami genetycznie zróżnicowanych koronawirusów podobnych do SARS (SL-CoV), a niektóre z nich mają potencjał do przenoszenia międzygatunkowego. W genomach dwóch (WIV1 i -16) niedawno wyizolowanych szczepów nietoperza SL-CoV, zidentyfikowano unikalną otwartą ramkę odczytu (ORFX). Dlatego kluczowe będzie wyjaśnienie, czy i w jaki sposób białko to przyczynia się do zjadliwości podczas infekcji wirusowej.

Wykazaliśmy tutaj, że unikalny ORFX jest funkcjonalnym genem, który bierze udział w modulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale nie jest niezbędny do replikacji wirusa in vitro. Nasze wyniki dostarczają ważnych informacji do dalszej eksploracji funkcji ORFX w przyszłości. Ponadto skonstruowany przez nas system genetyki odwrotnej będzie pomocny w badaniu patogenezy tej grupy wirusów oraz w opracowaniu środków terapeutycznych do przyszłej kontroli pojawiających się infekcji podobnych do SARS.

Koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) jest odzwierzęcym patogenem, który spowodował pandemię SARS w latach 2002-2003, która powstała w Chinach (1). Od tego czasu genetycznie zróżnicowane koronawirusy podobne do SARS (SL-CoV) były zgłaszane u nietoperzy w Chinach, Europie i Afryce (2–11), co wskazuje na szerokie geograficzne rozmieszczenie tej grupy wirusów. Jednak większość SL-CoV nietoperzy została zidentyfikowana tylko przez sekwencje i nie została w pełni scharakteryzowana ze względu na brak hodowanych wirusów. W związku z tym ich potencjał przenoszenia się i prawdopodobna patogeneza u zwierząt domowych i ludzi pozostaje niezbadany.

WIV1 i WIV16 to dwa niedawno zidentyfikowane szczepy SL-CoV o wysokim podobieństwie genomowym do ludzkiego SARS-CoV. Te dwa szczepy z powodzeniem hodowano in vitro i wykazano, że wykorzystują tę samą cząsteczkę (enzym konwertujący angiotensynę [ACE 2]) do wejścia do komórki co SARS-CoV (2, 10). Ostatnio wykazano, że inny szczep nietoperza SL-CoV, SHC014, wykorzystuje ludzki ACE 2 przez konstruowanie zakaźnego klonu cDNA (12). Ponadto eksperymenty na zwierzętach wykazały, że SL-CoV WIV1 i SHC014 mogą się wydajnie replikować i powodować niską patogenezę u transgenicznych myszy ACE 2 (12, 13). Fakt, że natywne szczepy nietoperzowe SL-CoV mogą wykorzystywać ludzki ACE 2 bez żadnych mutacji, wskazuje na wysokie ryzyko przenoszenia międzygatunkowego tych i podobnych koronawirusów, które mogą występować w naturalnych rezerwuarach.

[...]

MATERIAŁY I METODY [tylko tytuły akapitów – mój przypis]: Wirus i komórki; Plazmidy; Testy infekcji wirusowej; Klonowanie cDNA szczepu WIV1; Strategia modyfikacji pBeloBAC11 [pBeloBAC11 to wektor do klonowania plazmidu E. coli zaprojektowany do konstrukcji sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) – mój przypis]; Konstruowanie zakaźnych klonów sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) szczepu WIV1; Konstruowanie mutantów szczepu WIV1; Transfekcja zakaźnych klonów BAC szczepu WIV1; Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP); Analiza hybrydyzacji Northern; RT-PCR transkryptów zawierających lidera; Lokalizacja subkomórkowa ORFX; Testy lucyferazy i ilościowa PCR; Test translokacji IRF3; Ilościowa ocena ekspresji mRNA cytokin w zakażonych komórkach Calu-3; Test wrażliwości na interferon IFN-β; Statystyki.

WYNIKI [tylko tytuły akapitów – mój przypis]: Strategia budowy zakaźnego BAC szczepu WIV1; Ratowanie zrekombinowanych wirusów; ORFX jest funkcjonalnym genem, który nie jest niezbędny do replikacji wirusa; Białko ORFX hamuje produkcję interferonu IFN-β; Mutant delecyjny ORFX wykazuje zwiększoną wrażliwość na interferon IFN-β; Białko ORFX aktywuje kompleks białkowy NF-κB.

DYSKUSJA

W badaniu tym opracowaliśmy szybką i oszczędną kosztownie metodę odwrotnej genetyki koronawirusów poprzez połączenie dwóch podejść opracowanych przez innych (29, 30). Nasza metoda pozwala dzielić genomy koronawirusów na wiele fragmentów i w jednym etapie wstawiać do plazmidu BAC. Rekombinowane wirusy mogą być następnie skutecznie uratowane przez bezpośrednią transfekcję konstruktów BAC. Ponieważ genomy można podzielić na wiele krótkich fragmentów, można łatwo wprowadzić do osobnika mutacje w poszczególnych fragmentach (31).[ …] W naszym badaniu odkryliśmy również za pomocą podwójnego testu lucyferazy, że nadekspresja ORFX może aktywować kompleks białkowy NF-κB (ryc. 6A). Ponadto, poziom TNFα-mRNA indukowany przez rekombinowany wirus typu dzikiego był znacząco wyższy niż indukowany przez mutanta delecyjnego ORFX, ale tylko w późnym stadium infekcji (Fig. 6E). Wyniki te wskazują, że ORFX uczestniczy również w aktywacji NF-κB. Zauważyliśmy, że aktywność hamowania IFN przez ORFX nie była zależna od dawki i zmniejszała się, gdy było więcej ekspresji ORFX. […] Należy zauważyć, że systemy wykrywania IFN i NF-κB zastosowane w tym badaniu, pochodziły i były stosowane w komórkach ludzkich. Ponieważ wrodzony układ odpornościowy nietoperzy jest szczególny i prawdopodobnie pod pewnymi względami niedostateczny w porównaniu z układem ludzkim (34), interesujące będzie przeprowadzenie tych samych badań na komórkach nietoperzy w celu ustalenia, czy białko ORFX ma takie same profile, jak te obserwowane w ludzkim systemie komórkowym. Opracowanie różnych linii komórkowych nietoperza (podkowca) Rhinolophus, który jest żywicielem rezerwuarowym SL-CoV, ułatwi te badania w przyszłości.

PODZIĘKOWANIA

[…] Praca ta została sfinansowana wspólnie przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81290341, 31321001 i 81401672) oraz Narodowe Instytuty Zdrowia USA (NIAID R01AI110964).

INFORMACJE DOTYCZĄCE FINANSOWANIA

Praca ta, w tym wysiłki Zheng-Li Shi, została sfinansowana przez Narodową Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC – National Natural Science Foundation of China) (81290341 i 31321001). Praca ta, w tym starania Piotra Daszaka, została sfinansowana przez Fundację na rzecz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIAID R01AI110964). Ta praca, w tym starania Xing-Yi Ge, została sfinansowana przez Narodową Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC) (81401672).

LITERATURA

1. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, Nicholls J, Yee WKS, Yan WW, Cheung MT, Cheng VCC, Chan KH, Tsang DNC,  Yung RWH, Ng TK, Yuen KY. 2003. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 361:1319–1325.

http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(03)13077-2.

2. Ge XY, Li JL, Yang XL, Chmura AA, Zhu G, Epstein JH, Mazet JK, Hu B, Zhang W, Peng C, Zhang YJ, Luo CM, Tan B, Wang N, Zhu Y, Crameri G, Zhang SY, Wang LF, Daszak P, Shi ZL. 2013. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503:535–538. http://dx.doi.org/10.1038/nature12711.

3. Yuan J, Hon CC, Li Y, Wang D, Xu G, Zhang H, Zhou P, Poon LL, Lam TT, Leung FC, Shi Z. 2010. Intraspecies diversity of SARS-like coronaviruses in Rhinolophus sinicus and its implications for the origin of SARS coronaviruses in humans. J Gen Virol 91:1058–1062. http://dx.doi.org/10.1099/vir.0.016378-0.

4. Drexler JF, Gloza-Rausch F, Glende J, Corman VM, Muth D, Goettsche M, Seebens A, Niedrig M, Pfefferle S, Yordanov S, Zhelyazkov L, Hermanns U, Vallo P, Lukashev A, Muller MA, Deng H, Herrler G, Drosten C. 2010. Genomic characterization of severe acute respiratory syndrome-related coronavirus in European bats and classification of coronaviruses based on partial RNA-dependent RNA

polymerase gene sequences. J Virol 84:11336 –11349. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.00650-10.

5. Tong S, Conrardy C, Ruone S, Kuzmin IV, Guo X, Tao Y, Niezgoda M, Haynes L, Agwanda B, Breiman RF, Anderson LJ, Rupprecht CE. 2009. Detection of novel SARS-like and other coronaviruses in bats from Kenya. Emerg Infect Dis 15:482–485. http://dx.doi.org/10.3201/eid1503.081013.

6. Lau SKP, Woo PCY, Li KSM, Huang Y, Tsoi HW, Wong BHL, Wong SSY, Leung SY, Chan KH, Yuen KY. 2005. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc Natl Acad Sci U S A 102:14040 –14045. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0506735102.

7. Li WH, Zhang CS, Sui JH, Kuhn JH, Moore MJ, Luo SW, Wong SK, Huang IC, Xu KM, Vasilieva N, Murakami A, He YQ, Marasco WA, Guan Y, Choe HY, Farzan M. 2005. Receptor and viral determinants of SARS-coronavirus adaptation to human ACE2. EMBO J 24:1634–1643.

http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600640.

8. He B, Zhang Y, Xu L, Yang W, Yang F, Feng Y, Xia L, Zhou J, Zhen W, Feng Y, Guo H, Zhang H, Tu C. 2014. Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome-like coronavirus from bats in China. J Virol 88:7070–7082. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.00631-14.

9. Ren W, Li W, Yu M, Hao P, Zhang Y, Zhou P, Zhang S, Zhao G, Zhong Y, Wang S, Wang LF, Shi Z. 2006. Full-length genome sequences of two SARS-like coronaviruses in horseshoe bats and genetic variation analysis. J Gen Virol 87:3355–3359. http://dx.doi.org/10.1099/vir.0.82220-0.

10. Yang XL, Hu B, Wang B, Wang MN, Zhang Q, Zhang W, Wu LJ, Ge XY, Zhang YZ, Daszak P, Wang LF, Shi ZL. 2015. Isolation and characterization of a novel bat coronavirus closely related to the direct progenitor of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Virol 90:3253–3256.

11. Lau SK, Li KS, Huang Y, Shek CT, Tse H, Wang M, Choi GK, Xu H, Lam CS, Guo R, Chan KH, Zheng BJ, Woo PC, Yuen KY. 2010. Ecoepidemiology and complete genome comparison of different strains of severe acute respiratory syndrome-related Rhinolophus bat coronavirus in China reveal bats as a reservoir for acute, self-limiting infection that allows recombination events. J Virol 84:2808–2819. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.02219-09.

12. Menachery VD, Yount BL, Jr, Debbink K, Agnihothram S, Gralinski LE, Plante JA, Graham RL, Scobey T, Ge XY, Donaldson EF, Randell SH, Lanzavecchia A, Marasco WA, Shi ZL, Baric RS. 2015. A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med 21:1508–1513. http://dx.doi.org/10.1038/nm.3985.

13. Menachery VD, Yount BL, Jr, Sims AC, Debbink K, Agnihothram SS, Gralinski LE, Graham RL, Scobey T, Plante JA, Royal SR, Swanstrom J, Sheahan TP, Pickles RJ, Corti D, Randell SH, Lanzavecchia A, Marasco WA, Baric RS. 2016. SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proc Natl Acad Sci U S A http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1517719113.

14. de Groot R, Baker S, Baric R, Enjuanes L, Gorbalenya A, Holmes K, Perlman S, Poon L, Rottier P, Talbot P, Woo P, Ziebuhr J. 2012. Family Coronaviridae, p 806–828. In King A, Adams M, Cartens E, Lefkowitz E (ed), Virus taxonomy: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA.

15. Woo PC, Lau SK, Lam CS, Lau CC, Tsang AK, Lau JH, Bai R, Teng JL, Tsang CC, Wang M, Zheng BJ, Chan KH, Yuen KY. 2012. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus. J Virol 86:3995–4008. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.06540-11.

16. Rota PA, Oberste MS, Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Penaranda S, Bankamp B, Maher K, Chen MH, Tong SX, Tamin A, Lowe L, Frace M, DeRisi JL, Chen Q, Wang D, Erdman DD, Peret TCT, Burns C, Ksiazek TG, Rollin PE, Sanchez A, Liffick S, Holloway B, Limor J, McCaustland K, Olsen-Rasmussen M, Fouchier R, Gunther S, Osterhaus ADME, Drosten C, Pallansch MA, Anderson LJ, Bellini WJ. 2003. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science 300:1394–1399. http://dx.doi.org/10.1126/science.1085952.

17. Li WD, Shi ZL, Yu M, Ren WZ, Smith C, Epstein JH, Wang HZ, Crameri G, Hu ZH, Zhang HJ, Zhang JH, McEachern J, Field H, Daszak P, Eaton BT, Zhang SY, Wang LF. 2005. Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses. Science 310:676–679. http://dx.doi.org/10.1126/science.1118391.

18. Yount B, Roberts RS, Sims AC, Deming D, Frieman MB, Sparks J, Denison MR, Davis N, Baric RS. 2005. Severe acute respiratory syndrome coronavirus group-specific open reading frames encode nonessential functions for replication in cell cultures and mice. J Virol 79:14909–14922. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.79.23.14909-14922.2005.

19. Liu DX, Fung TS, Chong KK-L, Shukla A, Hilgenfeld R. 2014. Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses. Antiviral Res 109:97–109. http://dx.doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.06.013.

20. Kopecky-Bromberg SA, Martinez-Sobrido L, Frieman M, Baric RA, Palese P. 2007. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J Virol 81:548–557. http://dx.doi.org/10.1128/JVI .01782-06.

21. Minakshi R, Padhan K, Rani M, Khan N, Ahmad F, Jameel S. 2009. The SARS coronavirus 3a protein causes endoplasmic reticulum stress and induces ligand-independent downregulation of the type 1 interferon receptor. PLoS One 4:e8342. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0008342.

22. Obitsu S, Ahmed N, Nishitsuji H, Hasegawa A, Nakahama K, Morita I, Nishigaki K, Hayashi T, Masuda T, Kannagi M. 2009. Potential enhancement of osteoclastogenesis by severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a/X1 protein. Arch Virol 154:1457–1464. http://dx.doi.org/10.1007/s00705-009-0472-z.

23. Kanzawa N, Nishigaki K, Hayashi T, Ishii Y, Furukawa S, Niiro A, Yasui F, Kohara M, Morita K, Matsushima K, Le MQ, Masuda T, Kannagi M. 2006. Augmentation of chemokine production by severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a/X1 and 7a/X4 proteins through NF-kappaB activation. FEBS Lett 580:6807–6812. http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2006.11.046.

24. Zhou P, Li H, Wang H, Wang LF, Shi Z. 2012. Bat severe acute respiratory syndrome-like coronavirus ORF3b homologues display different interferon antagonist activities. J Gen Virol 93:275–281. http://dx.doi.org /10.1099/vir.0.033589-0.

25. Ren W, Qu X, Li W, Han Z, Yu M, Zhou P, Zhang SY, Wang LF, Deng H, Shi Z. 2008. Difference in receptor usage between severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and SARS-like coronavirus of bat origin. J Virol 82:1899–1907. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.01085-07.

26. Perrotta AT, Been MD. 1991. A pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA. Nature 350:434–436. http://dx.doi.org/10.1038/350434a0.

27. Santoro MG, Rossi A, Amici C. 2003. NF-kappaB and virus infection: who controls whom. EMBO J 22:2552–2560. http://dx.doi.org/10.1093/emboj/cdg267.

28. DeDiego ML, Nieto-Torres JL, Jimenez-Guardeño JM, Regla-Nava JA, Castaño-Rodriguez C, Fernandez-Delgado R, Usera F, Enjuanes L. 2014. Coronavirus virulence genes with main focus on SARS-CoV envelope gene. Virus Res 194:124–137. http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.07.024.

29. Almazan F, Gonzalez JM, Penzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Duran J, Enjuanes L. 2000. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A 97:5516–5521. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.97.10.5516.

30. Yount B, Curtis KM, Baric RS. 2000. Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J Virol 74:10600–10611. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.74.22.10600-10611.2000.

31. Donaldson EF, Sims AC, Baric RS. 2008. Systematic assembly and genetic manipulation of the mouse hepatitis virus A59 genome. Methods Mol Biol 454:293–315. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-59745-181-9_21.

32. Fung TS, Liu DX. 2014. Coronavirus infection, ER stress, apoptosis and innate immunity. Front Microbiol 5:296. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2014.00296.

33. Chaudhari N, Talwar P, Parimisetty A, Lefebvre d’ Hellencourt C, Ravanan P. 2014. A molecular web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress. Front Cell Neurosci 8:213. http://dx.doi.org/10.3389/fncel.2014.00213.

34. Baker ML, Schountz T, Wang LF. 2013. Antiviral immune responses of bats: a review. Zoonoses Public Health 60:104–116. http://dx.doi.org/10.1111/j.1863-2378.2012.01528.x.

UWAGI

Autor bloga zwraca uwagę, że w powyższa praca powstała w ramach realizacji w latach 2014-2020 amerykańsko-chińskiego projektu badawczego, pod numerem R01AI110964, zatytułowanego "ZROZUMIENIE RYZYKA POJAWIENIA SIĘ KORONAWIRUSA NIETOPERZY" (UNDERSTANDING THE RISK OF BAT CORONAVIRUS EMERGENCE). Nadzór merytoryczny nad projektem należał do Petera Daszaka z EchoHealth Alliance, New York i Zheng-Li Shia z Wuhan Institute of Virology. Projekt został rozpoczęty dnia 1 czerwca 2014, a jego zakończenie (pomimo wywołanej pandemii, a może właśnie dlatego) planowane jest na 30 czerwca 2025.

Projekt ten  finansują agencje rządowe USA (NIH - National Institutes of Health, poprzez NIAID, kierowany przez Anthony'ego Fauci) i Chin (NSFC - National Natural Science Foundation of China), a jego koszt po stronie USA wyniósł nie mniej, niż USD 3.748.715, zgodnie z przedstawioną poniżej oficjalną informacją o finansowaniu (Award Information). 

Nie uwzględnione są tutaj finansowania Wuhańskiego Instytutu Wirusologii (WIV) przez inne instytucje rządowe USA, na przykład przez podlegającą Departmentowi Stanu U.S. Agency for International Development (USAID). W jeszcze większym zakresie WIV finansowany był pośrednio - poprzez EcoHealth Alliance (EHA), z funduszów amerykańskiego Department of Defense (Pentagon). Jak poinformował 4 czerwca 2021 Richard H. Ebright, biolog molekularny, profesor chemii i biologii chemicznej na Uniwersytecie Rutgers w New Jersey, oraz dyrektor laboratorium w Waksman Institute of Microbiology, Pentagon przekazał w latach 2013-2020 do EHA kwotę około 39 milionów dolarów na badania broni biologicznej.  Łącznie organizacja Petera Daszaka otrzymała z państwowych źródeł około 123 miliony dolarów.

Pomimo ujawniania coraz większej ilości dokumentów oraz publikacji kolejnych artykułów naukowych, podważających przyjęte oficjalne stanowisko WHO, Chin i USA o "naturalnym" pochodzeniu koronawirusa, wywołującego chorobę Covid-19, władze medyczne USA postanowiły z dniem 8 lipca 2020 wznowić finansowanie powyższego projektu, zgodnie z listem Ministerstwa Zdrowia USA (Department of Health & Human Services) z tego dnia, w którym ministerstwo to pisze:

"W nawiązaniu do mojego poprzedniego pisma z dnia 24 kwietnia 2020 r. piszę, aby poinformować, że National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), instytut w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), podlegający Ministerstwu Zdrowia i Opieki Społecznej (HHS), wycofał swoje zakończenie grantu R01AI110964, który wspiera projekt "Zrozumienie ryzyka pojawienia się koronawirusa nietoperzy". W związku z tym dotacja ta zostaje przywrócona".

Strona amerykańska w podsumowaniu Award Information przedstawiła następujące uzasadnienie projektu.

Cytat:

Nowe odzwierzęce, pochodzące od nietoperzy, koronawirusy (CoV) stanowią poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia i bezpieczeństwa żywnościowego, jako przyczyna epidemii SARS w Chinach w 2002 roku, trwającego wybuchu epidemii MERS oraz nowo powstałego Zespołu Świńskiej Ostrej Biegunki w Chinach. W poprzednim projekcie R01 stwierdziliśmy, że nietoperze w południowych Chinach mają niezwykłą różnorodność SARSr-CoV, z których niektóre mogą wykorzystywać ludzkie ACE2 do wnikania do komórek, infekowania humanizowanych modeli myszy wywołujących choroby podobne do SARS i zdolnych do unikania dostępnych terapii lub szczepionek.

Odkryliśmy, że ludzie żyjący w pobliżu siedlisk nietoperzy są głównymi grupami ryzyka rozprzestrzeniania się, że w jednym miejscu istnieją różne SARSr-CoV, które zawierają każdy element genetyczny genomu SARS-CoV, oraz zidentyfikowaliśmy serologiczne dowody narażenia człowieka wśród ludzi żyjących w pobliżu. Odkrycia te doprowadziły do ​​opublikowania 18 artykułów, które zostały zrecenzowane, w tym dwóch artykułów w „Nature” i przeglądu w czasopiśmie „Cell”.

Pozostają jednak najistotniejsze pytania dotyczące pochodzenia, różnorodności, zdolności do wywoływania chorób i ryzyka rozprzestrzeniania się tych wirusów. W tym odnowieniu projektu R01 zajmiemy się tymi kwestiami poprzez 3 konkretne cele:

Cel 1. Scharakteryzowanie różnorodności i dystrybucji SARSr-CoV o wysokim ryzyku rozprzestrzeniania się u nietoperzy w południowych Chinach. Wykorzystamy analizy filologiczne i analizy krzywej wykrywania wirusów, aby ukierunkować się na dodatkowe pobranie próbek nietoperzy i molekularne badania przesiewowe CoV, aby wypełnić luki w naszym poprzednim pobieraniu próbek i w pełni scharakteryzować naturalną różnorodność SARSr-CoV w południowych Chinach. Zsekwencjonujemy domeny wiążące receptor (białka kolca), aby zidentyfikować wirusy o największym potencjale rozprzestrzeniania się, które uwzględnimy w naszych badaniach eksperymentalnych (Cel 3).

Cel 2. Nadzór nad syndromami środowiskowymi i klinicznymi w celu wychwycenia rozprzestrzeniania się SARSr-CoV, dróg narażenia i potencjalnych konsekwencji dla zdrowia publicznego. Będziemy prowadzić nadzór biologiczno-behawioralny w populacjach wysokiego ryzyka, z rozpoznanym kontaktem z nietoperzami, w warunkach środowiskowych i klinicznych, aby 1) zidentyfikować czynniki ryzyka dla dowodów serologicznych i PCR nietoperzowych wirusów SARSr-CoV; oraz 2) ocenić możliwe skutki zdrowotne zakażenia SARSr-CoV u ludzi. Przeanalizujemy serologię nietoperzowych koronawirusów pod kątem kontaktu z ludźmi i danych dotyczących ich narażenia, aby określić ilościowo czynniki ryzyka i wpływu na zdrowie z powodu rozprzestrzeniania się SARSr-CoV.

Cel 3. Charakterystyka ryzyka rozprzestrzeniania się SARSr-CoV in vitro i in vivo, w połączeniu z analizami przestrzennymi i filogenetycznymi, w celu zidentyfikowania regionów i wirusów stanowiących zagrożenie dla zdrowia publicznego. Wykorzystamy dane dotyczące sekwencji białka S, technologię klonów zakaźnych, eksperymenty z infekcjami in vitro oraz in vivo oraz analizę wiązania receptora, aby przetestować hipotezę, że procentowe progi dywergencji w sekwencjach białka S wyznaczają potencjał rozprzestrzeniania się epidemii. Połączymy te dane z rozmieszczeniem nietoperzowych żywicieli, różnorodnością wirusów i filogenezą, z badaniem ludzkich zachowań ryzykownych i chorób wśród ludzi oraz serologią, aby zidentyfikować ogniska ryzyka rozprzestrzeniania się SARSr-CoV w południowych Chinach.

Razem te dane i analizy będą miały kluczowe znaczenie dla przyszłego rozwoju interwencji w zakresie zdrowia publicznego i wzmocnionego nadzoru, aby zapobiec ponownemu pojawieniu się SARS lub pojawieniu się nowego SARSr-CoV.

Koniec cytatu.

Należy zwrócić uwagę na fakt być może najważniejszy -  powyższy artykuł, autorstwa Zheng-Li Shia z zespołem chińskim i Petera Daszaka z USA, finansowany przez rząd USA za pośrednictwem Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), kierowanym przez Antoniego Fauci, de facto udokumentował labolatoryjne stworzenie wirusa podobnego do SARS, z wmontowanym dodatkowym białkiem, które hamuje wytwarzanie przez organizm interferonu, niezbędnego do walki z wirusami. To dlatego cechą obecnej choroby Covid-19 jest większa na nią odporność  wśród młodych ludzi, bowiem młode organizmy wytwarzają większe ilości interferonu (uwalniającego się  przez komórki ciała w odpowiedzi na obecność patogenów), niż osoby starsze i są przez to generalnie mniej dotknięci skutkami zakażenia koronawirusem.

Twierdzenie o naturalnym pochodzeniu SARS-CoV-2 jest podważane przez problemy z sekwencjami genomu jego szczepów pokrewnych

Sekwencje koronawirusa RaTG13, MP789 i RmYN02 rodzą wiele pytań, do których społeczność naukowa winna się krytycznie ustosunkować.

Oryginalny tytuł: "SARS-CoV-2′s claimed natural origin is undermined by issues with genome sequences of its relative strains. Coronavirus sequences RaTG13, MP789 and RmYN02 raise multiple questions to be critically addressed by the scientific community".

Autorzy: Yuri Deigin (Youthereum Genetics Inc., Toronto, ON Canada), Rossana Segreto (Department of Microbiology, University of Innsbruck, Austria)

Data publikacji: BioEssays, 27 maja 2021.

Streszczenie

RaTG13, MP789 i RmYN02 to szczepy najbliższe SARS-CoV-2, a ich istnienie wyszło na jaw dopiero po rozpoczęciu pandemii. Ich genomy zostały wykorzystane do potwierdzenia naturalnego pochodzenia SARS-CoV-2, ale po dokładnym zbadaniu wszystkie one wykazują kilka otwartych problemów. W szczególności odnosimy się do obecności w RmYN02 i blisko spokrewnionych szczepach RacCSxxx deklarowanej naturalnej insercji aminokwasów PAA/PVA, na połączeniu S1/S2 ich białka kolca (białka S), w tej samej pozycji, w której insercja PRRA w SARS-CoV-2 stworzyła wielozasadowe miejsce rozszczepienia furyny. Pokazujemy, że RmYN02/RacCSxxx, zamiast przypisywanej insercji, zawiera 6-nukleotydową delecję w tym regionie i że 12-nukleotydowa insercja w SARS-CoV-2 pozostaje unikalna wśród Sarbecowirusów. Ponadto nasza analiza zestawów danych metagenomicznych RaTG13 i RmYN02 wykryła nieoczekiwane odczyty, które mogą wskazywać na możliwe zanieczyszczenie. Ze względu na ich znaczenie dla wnioskowania o pochodzeniu SARS-CoV-2, wzywamy do starannej, ponownej oceny zapisów sekwencjonowania RaTG13, MP789 i RmYN02 oraz metod składania.

Wprowadzenie

SARS-CoV-2 drastycznie zmienił świat, powodując katastrofalną śmiertelność i ogromne zakłócenia gospodarcze. Ustalenie jego pochodzenia ma zatem ogromne znaczenie, ale ponad rok od wybuchu epidemii w Wuhan społeczność naukowa nadal stoi przed znalezieniem ostatecznej odpowiedzi. Poszukiwanie pochodzenia SARS-CoV-2 w przyrodzie polega na znalezieniu blisko spokrewnionych sekwencji koronawirusa (CoV) u pierwotnych lub wtórnych gospodarzy, jako możliwego źródła odzwierzęcego rozprzestrzeniania się tego wirusa na ludzi. RaTG13, [1] MP789, [2] i RmYN02 [3] należą do zidentyfikowanych dotychczas sekwencji CoV, najściślej spokrewnionych z SARS-CoV-2, a ich istnienie wyszło na jaw dopiero po rozpoczęciu pandemii. Niezliczone publikacje naukowe odnoszą się do tych kluczowych sekwencji, w swoich próbach ustalenia pochodzenia SARS-CoV-2. Po dokładnym zbadaniu, wszystkie te trzy sekwencje i/lub artykuły, w których zostały one opisane po raz pierwszy, są obarczone kilkoma otwartymi problemami, które powinny być uważnie omówione przez społeczność naukową.

Dodatek do artykułu opisującego pierwszy RaTG13 wywołuje więcej pytań, niż udziela odpowiedzi

Wkrótce po rozpoczęciu pandemii Zhou i in. [1] opublikowali kluczowy artykuł, po raz pierwszy opisujący RaTG13, który jest najbliższym krewnym SARS-CoV-2, znalezionym do tej pory (96,2% tożsamości). Autorzy opublikowali wówczas bardzo niewiele informacji na temat miejsca pobierania próbek i metod sekwencjonowania. Zhou i in. [1] stwierdzili: „Następnie odkryliśmy, że krótki region polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) z koronawirusa nietoperza (BatCoV RaTG13) — który został wcześniej wykryty w Rhinolophus affinis z prowincji Junnan – wykazał wysoką identyczność sekwencji do 2019-nCoV. Na tej próbce RNA przeprowadziliśmy sekwencjonowanie pełnej długości”.

Co ciekawe, w przeddruku (pierwszej publikacji, poza czasopismem naukowym) [4] do powyższego artykułu cytowane zdanie pierwotnie brzmiało „co wcześniej wykryliśmy”, a nie „co zostało wcześniej wykryte”. Nie jest jasne, dlaczego autorzy postanowili jeszcze bardziej zdystansować się od kolekcji RaTG13 w ostatecznej wersji swojego artykułu.

Po wielokrotnych prośbach od kilku naukowców i dziennikarzy o wyjaśnienia, dopiero ponad 9 miesięcy później, artykuł Zhou et al. [1] został uzupełniony Dodatkiem (Addendum) [1], który zawiera niektóre brakujące informacje na temat RaTG13, z których większość została i tak już wcześniej odkryta i udostępniona opinii publicznej przez niezależną grupę badawczą o nazwie „DRASTIC” [5] oraz opublikowana przez Rahalkar i Bahulikar [6] oraz Segreto i Deigin [7].

Chociaż Dodatek wyjaśnia kilka kluczowych punktów, takich jak dokładna lokalizacja pobierania próbek RaTG13 i wspomina oryginalny artykuł to opisujący [8], opublikowana informacja jest nadal niekompletna i częściowo sprzeczna z wcześniej dostarczonymi danymi. Dodatek wyjaśnia w tym względzie, że RaTG13 został w pełni zsekwencjonowany w 2018 roku [5], a nie po rozpoczęciu pandemii, jak pozornie sugerowali Zhou i in. [1], w wyniku dopasowania SARS-CoV-2 do tego krótkiego regionu RdRp.

Należy zauważyć, że gdyby pełny genom RaTG13 był obecny w ich bazie danych od 2018 roku, to od razu zostałby uznany za najlepiej pasujący do SARS-CoV-2, kiedy o to pytano w 2020 roku, bez konieczności wspominania o dopasowaniu do jego krótkiego region RdRp.

Co więcej, Dodatek potwierdza naszą sugestię [7], że częściowa polimeraza RdRp wirusa RaTG13, wspomniana przez Zhou i in. [1], mogła być wcześniej nazwaną wirusem RaBtCoV/4991 [8], która jest próbką pobraną w 2013 roku w kopalni, w której sześciu pracowników – z których trzech zmarło – zachorowało na zapalenie płuc z bardzo podobnymi objawami jak SARS-CoV-2, a później czterech z nich zostało potwierdzone przez WIV jako noszące przeciwciała przeciwko SARS [6, 7].

Należy wspomnieć, że proces recenzowania artykułu Zhou [1] nie zapewnił, aby autorzy liczbowo zdefiniowali stwierdzoną przez nich „wysoką identyczność sekwencji” częściowego RdRp wirusa RaTG13 z SARSCoV-2, co zamiast nich zrobili Chen i in. [9], w pracy złożonej do publikacji w tym samym okresie, która stwierdzała identyczność RaBtCoV/4991 w 98,7% z SARSCoV-2 MN988668 i MN988669.

Ponadto nowe informacje ujawnione w Dodatku są takie, że osiem innych wirusów beta-SARSr-CoV, daleko spokrewnionych z SARS-CoV, zostało również wyizolowanych z tej samej kopalni Mojiang i zsekwencjonowanych razem z RaTG13, ale nie podano ani ich genomów, ani informacji o nazwach próbek i ewentualnych numerów dostępu. Nie wiadomo, jak te sekwencje odnoszą się do RaTG13. Dodatek nie podaje również szczegółów dotyczących liczby i rodzaju próbek pobranych od pracowników kopalni, warunków ich przechowywania, metod zastosowanych w każdym opisanym teście i specyfikacji uzyskanych wyników.

Ponadto Dodatek nie odnosi się do i/lub jest sprzeczny ze stwierdzeniami w pracach magisterskich [10] i doktorskich [11 ,12], które wcześniej szczegółowo opisywały objawy zapalenia płuc u górników i stwierdzały, że przeciwciała SARS immunoglobuliny G (IgG) zostały wykryte przez Wuhan Institute of Virology (WIV) we wszystkich czterech, pobranych od górników i przetestowanych próbkach.

Różne przeddruki [13–16] kwestionowały ważność zbioru danych metagenomicznych, na którym oparty jest RaTG13. Dla niezależnej analizy danych nieprzetworzonych, wykorzystywanych do składania RaTG13, wykorzystaliśmy oprogramowanie NCBI BLAST (Blastn Suite) przy użyciu RaTG13 (MN996532.2), jako sekwencji zapytania wobec nieprzetworzonych odczytów RaTG13 (SRX7724752) i amplikonów (SRX8357956) [BLAST to oprogramowanie, pozwalające na odnajdywanie regionów podobieństwa między sekwencjami biologicznymi. NCBI – National Center for Biotechnology Information, USA].

Pierwsze 14 nukleotydów (nt) końca 5′ z RaTG13 nie miało sekwencji dopasowania, co jest nieoczekiwane nie tylko dlatego, że wpis Genbank dla RaTG13 został zredagowany 13 października 2020 [17], a koniec 5′ był dodany bez wsparcia z danych nieprzetworzonych, ale także dlatego, że że stwierdzono, że próbka została całkowicie wyczerpana podczas jej sekwencjonowania w 2018 roku [18]. W tej samej aktualizacji poprawiono również niewielką liczbę nukleotydów, prawdopodobnie naprawiając błędy składania uwolnienia pierwszego genomu. Ponieważ wszystkie te modyfikacje zostały wprowadzone bez wyjaśnień i bez włączenia do tekstu dalszych danych sekwencjonowania, wzywamy do udostępnienia informacji na temat procesu składania pierwszego genomu RaTG13, który ma zostać uwolniony wraz z odczytami potwierdzającymi podstawy sprzeczne z danymi z sekwencjonowania.

Aby zweryfikować krytykę wyrażoną w związku z niską w RaTG13 liczbą odczytów bakterii, które są nieoczekiwane dla wymazu kałowego, przeprowadziliśmy analizę taksonomiczną odczytów nieprzetworzonych, przy użyciu NCBI SRA, narzędzia do analizy taksonomii. Tylko 0,65% nieprzetworzonych (surowych) odczytów składało się z bakterii, a znaczna ilość sekwencji nieoczekiwanie należała do gatunków z siedliskami daleko poza prowincją Junnan w Chinach (4,6% Rousettus aegyptiacus; 4,6% Marmota marmota marmota; 3,6% Marmota flaviventris). Anomalnie niska ilość bakterii jest uderzająca, gdy porówna się z surowymi odczytami z wymazu kałowego Rhinolophus affinis (SRR11085736) przesłanymi do Genbank przez WIV tego samego dnia, jako zbiór danych RaTG13 (13 lutego 2020), a który zawiera 91% bakterii.

Zhang [13] i Singla [15] zidentyfikowali jeszcze w surowych odczytach RaTG13 obecność niezwykle obfitych sekwencji podobnych do telomerów. Telomery to struktury DNA-białko złożone z powtórzeń tandemowych które znajdują się na końcu chromosomów i zwykle reprezentują tylko niewielka część całkowitego komórkowego RNA wyekstrahowanego z próbki biologicznej. Za pomocą TelomereCat obliczyliśmy [19], że surowe odczyty RaTG13 (dostęp do GenBank SRX7724752) składają się z 14% w pełni telometrycznych sekwencji. Pochodzenie tych powtórzeń jest niewyjaśnione i dokładniejsze badanie sekwencji podobnych do telomerów w zbiorze danych jest konieczne.

Następnie uruchomiliśmy BLASTn dla losowo wybranych surowych odczytów z zestawu danych RaTG13 w porównaniu z bazą danych NCBI Nucleotide Collection Database, używając minimalnego podobieństwa 95%, dopóki nie zarejestrowaliśmy 1698 trafień. Co zaskakujące, 10% zidentyfikowanych sekwencji pasowało do genomu Homo sapiens, co wskazuje na znaczne zanieczyszczenie zbioru danych RaTG13, co mogło się wydarzyć podczas sekwencjonowania lub oczyszczania z kultury komórek ludzkich.

Biorąc pod uwagę, że RaTG13 został przedstawiony jako dowód, że SARS-CoV-2 może naturalnie pochodzić od nietoperzy [1] i że dzieli wiele nowych cech z genomem SARS-CoV-2 — wśród nich obecność wielu insertów w białku S [1] – wirus RaTG13 nie powinien być wykorzystywany do wyciągania wniosków o naturalnym pochodzeniu SARS-CoV-2, dopóki niezawodność tego stwierdzenia jest udowodniona.

Ta sama sekwencja koronawirusa łuskowca MP789 została zacytowana przez kilka publikacji pod różnymi nazwami

Identyfikacja RBD (Receptor-Binding Domain - domena wiążąca receptor) bardzo podobnego do tego obecnego w SARSCoV-2 w CoV wyizolowanego z partii łuskowców przemyconych z prowincji Guangdong (GD, Chiny) w marcu 2019 roku [2], wznieciło spekulacje, że łuskowce mogły być potencjalnym gospodarzem SARSCoV-2 przed jego przeskokiem na ludzi, chociaż jego ogólne podobieństwo genomu do SARS-CoV-2 jest niższe, niż te RaTG13 [20]. Po dokładnym zbadaniu zgromadzonych genomów i surowych danych, Chan i Zhan [21] odkryli, że ta konkretna domena RBD została znaleziona tylko w dwóch (#7 i #8), z trzynastu zebranych próbek łuskowca, i że ten sam wynik złożonego genomu został inaczej nazwany przez Liu et al. [2] oraz Xiao et al.[20] - odpowiednio MP789 i GD_1.

Biorąc pod uwagę rzadkość tej specjalnej domeny RBD w analizowanych próbkach łuskowców, Chan i Zhan [21] dochodzą do wniosku, że łuskowce mogły zostać zakażone przez inne zwierzęta podczas handlu, a inni autorzy sugerują nawet możliwe zanieczyszczenie zbioru danych łuskowców przez ludzkie sekwencje [22] lub kultury komórek [23]. W oparciu o te ustalenia, Stowarzyszenie “U.S. Right to Know” zażądało szczegółowych wyjaśnień [24] na temat zbioru danych łuskowców od autorów Liu et al. [2] oraz Xiao et al. 20] oraz redaktorzy „PLoS Pathogens and Nature”, którzy opublikowali kilka artykułów opartych na tym samym zbiorze danych.[25,26]

Wiele pytań wciąż czeka na odpowiedź, ale w wyniku tego zapytania do Xiao et al. [20] dodano notatkę, ostrzegającą czytelników o bieżących problemach z próbką:

„Uwaga redaktora: Ostrzega się Czytelników, że podniesione zostały obawy co do tożsamości próbek łuskowców, opisanych w tym artykule i ich związku z wcześniej opublikowanymi próbkami łuskowców. Zostanie podjęteodpowiednie działanie redakcji po rozwiązaniu tej sprawy.”

Jednakże kilka opublikowanych artykułów w swoich analizach oparło się już na MP789, a mianowicie szeroko cytowana praca „The Proximal Origin of SARS-CoV2” opublikowana w „Nature Medicine”, autorstwa Andersena i in. [27], z której wynika, że SARS-CoV-2 najprawdopodobniej pochodzi z natury. Ostatnie analizy kwestionują możliwość występowania łuskowców jako możliwych żywicieli pośrednich dla SARS-CoV-2 [28, 29], dlatego Andersen et al. [27] oraz inni autorzy, powołujący się na MP789, powinni dokładnie przeanalizować swoje wnioski. Domena RBD w SARS-CoV-2, która wydaje się być wysoce przystosowana do ludzkiego enzymu ACE 2 [30] — nawet bardziej, niż ten rozwinięty przez ciężki ostry zespół oddechowy (SARS-CoV) w latach 2002/2003 [31] pozostaje bardzo osobliwą cechą.

Przypisywane wstawienie PAA/PVA w szczepy RmYN02/RacCSxxx jest wysoce wątpliwe

Zhou i in. [3] poinformowali o odkryciu RmYN02 - nowego szczepu CoV, który według autorów zawiera naturalną insercję aminokwasów PAA w połączeniu S1/S2 białka kolca w tej samej pozycji, co wstawka PRRA, która utworzyła wielozasadowe miejsce rozszczepienia furyny (FCS) w SARS-CoV-2. Podobnie ta sama grupa autorów również niedawno oznaczyła jako wstawienie bardzo podobnego fragmentu PVA w nowo zgłoszony klaster tajlandzkich CoV (RacCS203, RacCS264, RacCS271, dalej łącznie nazywany RacCSxxx) [32].

Zhou i in. [3] doszli do tego wniosku bazowanego na wielokrotności dopasowania sekwencji RmYN02 z kilkoma szczepami beta koronawirusa, mianowicie SARS-CoV-2, SARS-CoV GZ02, RaTG13, ZC45, ZXC21, Pangolin/GD/2019 (MP789) i Pangolin/GX/P5L/2017. Ich odkrycia są przedstawione na schemacie dopasowania pojedynczego aminokwasu, gdzie przypuszczalna insercja aminokwasu PAA jest umieszczona pomiędzy 680 (seryna) i 685 (arginina) aminokwasów białka kolca SARS-CoV-2. Autorzy nie podają szczegółów algorytmu, zastosowanego dla uzyskania dopasowania oraz na temat - czy podczas ich analizy wygenerowano alternatywne dopasowania. Biorąc pod uwagę, że żaden pojedynczy algorytm może w każdym przypadku osiągnąć najlepsze dostosowanie dla danego zbioru danych [33], wnioski należy wyciągnąć w oparciu o kilku metod wyrównania, a także przeprowadzoną walidację wyników przez wyszkolone ludzkie oko.

Co więcej, Zhou i in. [3] nie przedstawili dopasowania nukleotydów tego samego regionu, co mogłoby pozwolić czytelnikowi zidentyfikować podstawowe nukleotydy (CCT GCA GCG) kodujące żądaną insercję PAA w RmYN02, w stosunku do innych analizowanych szczepów. Przeprowadziliśmy więc z pomocą oprogramowania CLUSTAL W [34] dopasowanie sekwencji wielu nukleotydów szczepów, opisanych w Zhou i in. [3], ale nie byliśmy w stanie zaobserwować zgłaszanej insercji (Rys. 1A). Zamiast tego wydaje się, że RmYN02 zawiera 6-nukleotydową delecję na połączeniu S1/S2, w porównaniu do innych szczepów, a jedyne, zaobserwowane podczas wyrównywania tych samych genomów, których użyli Zhou i in. [3] wstawienie, jest dobrze znaną 12- nukleotydową insercją CT CCT CGG CGG G (PRRA) w SARS-CoV-2. 6-nukleotydowa delecja w RmYN02 na połączeniu S1/S2 jest jeszcze bardziej widoczna, gdy SARS-CoV-2 jest wykluczony z wielosekwencyjnego wyrównanie (Rys. 1B).

Rys. 1

(A) Wielosekwencyjne dopasowanie RmYN02 metodą Clustal W, dla porównania ze szczepami zastosowanymi w Zhou et al. Nukleotydy RmYN02 kodujące aminokwasy PAA (CCT GCA GCG) otoczone są czerwonym prostokątem. Nie widać insercji w RmYN02; wręcz przeciwnie, obserwuje się delecję rozdzielającą nukleotydy kodujące PAA. (B) Wielosekwencyjne dopasowanie RmYN02 metodą Clustal W, dla porównania ze szczepami zastosowanymi w Zhou et al., z wyjątkiem SARS-CoV-2. Wydaje się, że delecja charakteryzująca RmYN02 na połączeniu S1/S2 powoduje oddzielenie pierwszego nukleotydu od reszty sekwencji kodującej aminokwasy PAA (CCT GCA GCG, otoczona czerwonym prostokątem). (C) Porównanie parami RmYN02 (kotwica) z RaTG13, ZC45 i ZXC21. W tych porównaniach nie zaobserwowano insercji PAA w RmYN02. (D) Porównanie parami ZC45 (kotwica) z ZXC21, RmYN02, RaTG13 i Pangolin/GD/2019. Nukleotydy RmYN02 kodujące aminokwasy PAA (otoczone czerwonym prostokątem) są uszeregowane jako mutacje w stosunku do ZC45, a nie insercje. (E) Drzewo filogenetyczne SARS-GZ02, Pangolin/GX/2017, ZC45, ZXC21, RmYN02, RaTG13 i Pangolin/GD/2019 wyprodukowane przez program CLUSTAL W, na podstawie dopasowania ich genomów jak w (B).

Uważamy, że włączenie SARS-CoV-2 do danych wejściowych do algorytmu wielokrotnego dopasowania, wraz z RmYN02 i innymi szczepami, jak to uczynili Zhou i in. [3], jest metodologicznie niepoprawne, ponieważ leżąca u podstaw dorozumiana hipoteza, którą ich analiza miała na celu sprawdzić, jest to, czy insercja PRRA SARS-CoV-2 jest pochodzenia naturalnego. A zatem, włączenie SARS-CoV-2 do wyrównania nie tylko zniekształca algorytm wyrównania, ale również zakłada z góry wniosek, że wkładka PRRA jest rzeczywiście naturalna. Aby udowodnić, że wstawki takie jak PRRA występują naturalnie, szczepy które wykazują podobne wstawki musiałyby być porównane z ich bliskimi szczepami, wyłączając z analizy SARS-CoV-2.

Z naszych analiz wynika, że RmYN02 nie zawiera wstawki na połączeniu S1/S2, w porównaniu z najbliższymi krewnymi, a deklarowana insercja PAA jest bardziej prawdopodobna jako wynik wielokrotnych mutacji. Porównania parami między RmYN02 i jego najbliższymi krewnymi (RaTG13, ZC45, ZXC21) potwierdzają tę hipotezę, gdy albo RmYN02 (Rys. 1C) albo ZC45 (Rys. 1D) są używane jako kotwica, a zamiast tego wytwarzają delecję 2-nt w regionie kodującym PAA (Rys. 1D). Gdyby RmYN02 rzeczywiście miał wkładkę porównywalną z wstawieniem PRRA do SARS-CoV-2, oczekiwalibyśmy, iż takie wstawienie będzie wyraźnie obserwowalne w porównaniach parami, z najbliższymi krewnymi RmYN02, takimi jak RaTG13, ZC45, ZXC21 i Pangolin/GD/2019 (Rys. 1E).

Bliższe badanie regionu S1/S2 ujawnia, że w RmYN02 (wkładka) jest o sześć nukleotydów (dwa aminokwasy) krótsza, niż jego pokrewna szczepy RaTG13, Pangolin/GD/2019, ZC45 i ZXC21. Dlatego, aby wesprzeć deklarowaną insercję PAA, musiała wystąpić nie tylko 9-nukleotydowa insercja, ale również delecja 15 nukleotydów. Chociaż jest to teoretycznie możliwe, proponujemy dwie alternatywy bardziej oszczędnych wyrównań, które nie mają żadnych wstawek (wersje 1 i 2 na Rys. 2). Wyrównanie zaproponowane przez CLUSTAL W (Rys. 1B) również nie wytworzyło żadnych wstawek (wersja „Clustal W” na Rys 2).

Rys. 2

Dopasowania nukleotydowe i aminokwasowe RmYN02 z SARS-CoV-2, RaTG13, RShSTT182/200 (Kambodża), RacCS203/264/271 (Tajlandia), Pangolin/GD/2019, RmYN01, RP3, Rf4092, LYRa11, Rs3367, RsSHC014, ZC45 i ZXC21 na złączu S1/S2 białka kolca. W przypadku RmYN02 dostępne są trzy alternatywne wersje, oprócz tych zaproponowanych przez Clustal W i Zhou et al.

Zamiast całkowitej 12-nukleotydowej delecji regionu w RmYN02, która odpowiada QTQT w RaTG13, jak zaproponowali Zhou i in. [3], uważamy, że bardziej oszczędnym scenariuszem jest po prostu delecja 3-nukleotydowa: albo tylko delecja pierwszy kodon Q (wersja 2 na Rys. 2) lub nieciągła delecja 3-nt, podzielona pomiędzy nukleotydy kodujące QTQ, która zachowuje w RmYN02 i RacCSxxx ciągłą rozpiętość nukleotydów ACTCA z ich szczepów względnych, ale zamienia QTQ w NS (wersja 1 na Rys. 2, zakonserwowane nukleotydy zaznaczono na samej górze czerwonym prostokątem). Takie delecje mogą wynikać z „jąkania” (stutter) RdRp i mogą być tolerowane, o ile nie przesuwają ramki kodowania.

Inną możliwością, zaproponowaną przez CLUSTAL W, jest 6-nukleotydowa delecja w środku nukleotydów kodujących QTN, przekształcająca go w P. Jednak uważamy to zaproponowane dopasowanie za mało prawdopodobne, ponieważ P (kodowane przez CCT) w RmYN02 i RacCSxxx dobrze zakotwicza się w P (również kodowanym przez CCT) w szczepie PrC31 (EPI_ISL_1098866) (oznaczonym niebieskim prostokątem na Rys. 2).

Aminokwas I (kodowany przez ATA) następujący po P w PrC31 jest również dobrze dopasowany do aminokwasu V (kodowanego przez GTA), następującego po P w szczepach RacCSxxx. Ten sam aminokwas I (kodowany przez ATA) jest również obserwowany w szczepach ZC45 i ZXC21 w identycznej pozycji (oznaczonej czerwonymi prostokątami na dole Rys. 2).

Podobnie aminokwas A (kodowany przez GCA) następujący po P w RmYN02 jest dobrze wyrównany z aminokwasem S (kodowanym przez TCA) w szczepach Pangolin/GX/2017, Rs3367 i RsSHC014 (oznaczonych zieloną ramką na rysunku 2) .

Wreszcie, poprzedzający aminokwas P fragmentów PAA/PVA w RmYN02/RacCSxxx jest aminokwasem S (kodowanym przez TCA), który jest dobrze wyrównany z aminokwasem P (kodowanym przez CCA) w szczepie Rc-o319 (oznaczonym żółtą ramką na Rys. 2).

Rozstrzygającym dowodem na jakąkolwiek nową insercję sekwencji genetycznej jest istnienie blisko spokrewnionych szczepów bez tej sekwencji. W przypadku SARS-CoV-2 insercja PRRA jest oczywista, ponieważ blisko spokrewnione szczepy RaTG13 lub Pangolin/GD/2019 nie mają fragmentu PRRA, a jednocześnie mają prawie identyczne nukleotydy wokół tego samego locus, w którym SARS-CoV-2 ma wstawienie. W przypadku RmYN02/RacCSxxx, rzekoma insercja PAA/PVA jest zawsze połączona z rzekomą 4-aminokwasową delecją tuż przed fragmentem NSPAA/NSPVA. Ta delecja odpowiada fragmentowi QTQT w SARS-CoV-2, RaTG13 i Pangolin/GD/2019. Gdyby PAA/PVA rzeczywiście był insercją, można by oczekiwać blisko spokrewnionych szczepów, które nie mają jeszcze tej insercji, ale już mają rzekomą 4-aminokwasową delecję. W przypadku braku takich szczepów, bardziej oszczędnym wyjaśnieniem fragmentów PAA/PVA nie jest insercja 3-aa połączona z delecją 4-aa, ale mutacje punktowe i delecja 1-aa.

Podsumowując, powyższe obserwacje jednoznacznie pokazują, że fragmenty PAA/PVA w RmYN02/RacCSxxx nie stanowią nowych insercji, ale zamiast tego są dobrze dopasowane do istniejących fragmentów PIL/SIL w blisko spokrewnionych szczepach, a żadne dopasowanie RmYN02 lub RacCSxxx nie daje niczego, co mogłoby wspierać hipotezę zaproponowaną przez Zhou i in. [3] o połączonej delecji 15-nt i insercji 9-nt w RmYN02/RacCSxxx.

Na marginesie chcielibyśmy postawić hipotezę, że obserwowana 6-nukleotydowa delecja na połączeniu S1/S2 w szczepach RmYN02 i tajskim CoV RacCSxxx może nie być delecją per se, ale cechą przodków i mogą to być inne szczepy, które są tu o 6 nt dłuższe, u których przodka(ów) rozwinął w tym miejscu wstawkę o długości 6 nt.

Podczas gdy dalsze ekspedycje w celu zbierania wirusów mogą doprowadzić do nieoczekiwanych odkryć, do tej pory SARS-CoV-2 pozostaje wyjątkowy wśród swoich krewnych podrodzaju Sarbecovirus, nie tylko ze względu na wielozasadowe miejsce furyny na złączu S1/S2, ale także ze względu na długość locus otaczającego 12 – nukleotydową wstawkę, która utworzyła miejsce furyny: SARS-CoV-2 jest o co najmniej 12 nukleotydów dłuższy w tym połączeniu, niż którykolwiek z jego krewnych Sarbecovirus. Jego insercja PRRA nie budzi żadnych wątpliwości i nie towarzyszyły jej żadne delecje, co stoi w ostrym kontraście z tym, co obserwuje się w RmYN02. Wykazaliśmy, że RmYN02 nie może być użyty do potwierdzenia naturalnego pochodzenia miejsca cięcia furyny w SARS-CoV-2, a także jako konsekwencja samego SARS-CoV-2, jak stwierdzili Zhou i in. [3].

Aby zweryfikować obserwację dokonaną przez Signus [16] niezwykle wysokiej zawartości pojedynczej 3'-ETS (External Transcribed Spacer, fragment niefunkcjonalnego RNA), sekwencji Homo sapiens w zestawie danych sekwencjonowania metatranskryptomicznego, użytym do złożenia RmYN02 (SRR12432009), uruchomiliśmy BLASTn dla losowo wybranych surowych odczytów z SRR12432009, względem bazy danych NCBI (Nucleotide Collection Database), stosując minimalne podobieństwo 95%, dopóki nie zarejestrowaliśmy 4428 trafień.

Co zaskakujące, odkryliśmy, że 75% odczytów pasowało do sekwencji Genbank „gen Homo sapiens rybosomalnego RNA ETS 18S”, podczas gdy 2,5% pasowało do sekwencji CoV Chiroptera lub nietoperza. Dominująca obecność pojedynczego ludzkiego genu RNA w zestawie danych, wykorzystanym do składania RmYN02 sugeruje, że również metagenomiczny zestaw danych RmYN02 jest wyraźnie zanieczyszczony, jak stwierdzono w przypadku RaTG13, i nie należy na nim polegać w celach badawczych, dopóki nie zostanie zweryfikowany.

Na zakończenie chcielibyśmy zwrócić uwagę na inne niewłaściwe ułożenie w przeddruku Zhou et al. [32: na ryc. 4 autorzy błędnie przesuwają fragment RSANNN Rc-o319 o jeden aminokwas w lewo, wyrównując go z fragmentem ARSVAS SARS-CoV-2. Jednak, jak pokaże szybkie spojrzenie wyszkolonego oka na leżące u podstaw nukleotydy, fragment RSANNN Rc-o319 najlepiej pasuje do RSVN-Q z Pangolin/GX/2017 na tej samej ryc. 4. Kolejny dowód w naszej analizie (Rys. 2) na to dopasowanie dostarczają PrC31, Rs3367 i RsSCH014.

Ostatnią drobną kwestią, którą chcielibyśmy poruszyć, jest to, że złożona sekwencja RmYN02 jest obecnie dostępna tylko w bazie danych GISAID, która jest chroniona hasłem i wymaga rejestracji. Proponujemy, aby RmYN02 był również dostępny w GenBank.

Wnioski

RaTG13, MP789 i RmYN02 należą do najbliższych krewnych SARS-CoV-2, a zatem mają ogromne znaczenie jako kluczowe narzędzia do wnioskowania o powiązaniach filogenetycznych SARS-CoV-2 i identyfikacji specyficznych cech genetycznych SARS-CoV-2, z ostatecznym celem odkrycia jego pochodzenia.

Sekwencje te były szeroko stosowane do wspierania naturalnego pochodzenia SARS-CoV-2, ale po dokładnym zbadaniu wszystkie z nich wykazują problemy, które należy konkretnie rozwiązać i wyjaśnić. Należy również zauważyć, że amplikony i surowe dane związane z tymi sekwencjami zostały udostępnione dopiero na prośbę naukowców chcących zweryfikować złożone opublikowane genomy. Brak dokładności oraz brakujące lub sprzeczne informacje w dokumentach opisujących te kluczowe sekwencje powinny zostać rozwiązane podczas dokładnego procesu recenzowania.

Biorąc pod uwagę krytykę wyrażoną przez kilku badaczy na temat tych sekwencji i powiązanych artykułów, przy wyciąganiu wniosków na temat pochodzenia SARS-CoV-2 należy wziąć pod uwagę alternatywne analizy oparte wyłącznie na sekwencjach opublikowanych przed wybuchem pandemii.

Podsumowując, proponujemy, aby proces przeglądu wszystkich artykułów opisujących najbliższych krewnych SARS-CoV-2, które mogłyby przyczynić się do identyfikacji pochodzenia SARS-CoV-2, został upubliczniony, umożliwiając otwartą i krytyczną ocenę przez całe środowisko naukowe .

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni grupie D.R.A.S.T.I.C. ((Decentralised Radical Autonomous Search Team Investigating COVID-19) na Twitterze, za całą ich pracę w odkrywaniu większości wcześniej niepublikowanych faktów na temat SARS-CoV-2 i jego szczepów pokrewnych. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Daoyu Zhangowi i Adrianowi Jonesowi za pomoc w analizie surowych danych sekwencjonowania RaTG13 i RmYN02.

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Oświadczenie o dostępności danych

Kod źródłowy wszystkich analiz można znaleźć na:

https://github.com/bioscienceresearch/Genome_Sequence_Reliability

Bibliografia

1. Zhou, P., Yang, X.-L., Wang, X.-G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.-R., Zhu, Y., Li, B., Huang, C.-L., Chen, H.-D., Chen, J., Luo, Y., Guo, H., Jiang, R.-D., Liu, M.-Q., Chen, Y., Shen, X.-R., Wang, X., Zheng, X.-S., Zhao, K., Chen, Q.-J., Deng, F., Liu, L. L., Yan, B., Zhan, F.-X., Wang, Y.-Y., Xiao, G.-F., Shi, Z.-L. (2020). "A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin". Nature, 579, 270– 273. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7

2. Liu, P., Chen, W., & Chen, J. P. (2019). "Viral metagenomics revealed Sendai virus and coronavirus infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)". Viruses, 11(11), 979.

https://doi.org/10.3390/v11110979

3. Zhou, H., Chen, X., Hu, T., Li, J., Song, H., Liu, Y., Wang, P., Liu, D., Yang, J., Holmes, E. C., Hughes, A. C., Bi, Y., & Shi, W. (2020). "A novel bat coronavirus closely related to SARS-CoV-2 contains natural insertions at the S1/S2 cleavage site of the spike protein". Current Biology, 30, 2196– 2203.e3. https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.05.023

4. Zhou, P., Yang, X.-L., Wang, X.-G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.-R., Zhu, Y., Li, B., Huang, C.-L., Chen, H.-D., Chen, J., Luo, Y., Guo, H., Jiang, R.-D., Liu, M.-Q., Chen, Y., Shen, X.-R., Wang, X., Zheng, X.-S., Zhao, K., Chen, Q.-J., Deng, F., Liu, L.-L., Yan, B., Zhan, F.-X., Wang, Y.-Y., Xiao, G., Shi, Z.-L. (2020). "Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin". BioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.01.22.914952

5. Colaiacovo, M. (2020). "The origin of SARS-CoV-2 is a riddle: Meet the Twitter detectives who aim to solve it". https://mygenomix.medium.com/the-origin-of-sars-cov-2-is-a-riddle-meet-the-twitter-detectives-who-aim-to-solve-it-5050216fd279

6. Rahalkar, M. C., & Bahulikar, R. A. (2020). "Lethal pneumonia cases in Mojiang Miners (2012) and the mineshaft could provide important clues to the origin of SARS-CoV-2". Frontiers in Public Health. https://doi.org/10.3389/fpubh.2020.581569

7. Segreto, R., & Deigin, Y. (2020). "The genetic structure of SARS-CoV-2 does not rule out a laboratory origin: SARS-COV-2 chimeric structure and furin cleavage site might be the result of genetic manipulation". Bioessays, 43, 1- 9. https://doi.org/10.1002/bies.202000240

8. Ge, X. Y., Wang, N., Zhang, W., Hu, B., Li, B., & Zhang, Y. Z., Zhou, J.-H., Luo, C.-M., Yang, X.-L., Wu, L.-J., Wang, B., Zhang, Y., Li, Z.-X., & Shi, Z.-L. (2016). "Coexistence of multiple coronaviruses in several bat colonies in an abandoned mineshaft". Virologica Sinica, 31, 31– 40. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3713-9

9. Chen, L., Liu, W., Zhang, Q., Xu, K., Ye, G., Wu, W., Sun, Z., Liu, F., Wu, K., Zhong, B., Mei, Y., Zhang, W., Chen, Y., Li, Y., Shi, M., Lan, K., & Liu, Y. (2020). "RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak". Emerging Microbes & Infections, 9, 313– 319. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1725399

10. Xu, L. (2013). "The analysis of 6 patients with severe pneumonia caused by unknown viruses" (Master's Thesis). Kunming Medical University, Emergency Medicine (professional degree). http://eng.oversea.cnki.net/Kcms/detail/detail.aspx?filename=1013327523.nh&dbcode=CMFD&dbname=CMFD2014

11. Huang, C. (2016). "Novel virus discovery in bat and the exploration of receptor of bat coronavirus HKU9". (PhD Thesis). Chinese Center for Disease Control and Prevention.

http://eng.oversea.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&dbname=CDFDLAST2018&filename=1017118517.nh

12. Latham, J., & Wilson, A., "A Chinese PhD Thesis sheds important new light on the origin of the COVID-19 coronavirus". https://www.independentsciencenews.org/commentaries/a-chinese-phd-thesis-sheds-important-new-light-on-the-origin-of-the-covid-19-coronavirus/

13. Zhang, D. (2020). "Anomalies in BatCoV/RaTG13 sequencing and provenance". Zenodo.

http://doi.org/10.5281/zenodo.4064067

14. Rahalkar, M. C., & Bahulikar, R. A. (2020). "The anomalous nature of the fecal swab data, receptor binding domain and other questions in RaTG13 genome". Preprints.

https://www.preprints.org/manuscript/202008.0205/v3

15. Singla, M., Ahmad, S., Gupta, C., & Sethi, T. (2020). "De-novo assembly of RaTG13 genome reveals inconsistencies further obscuring SARS-CoV-2 origins". Preprints.

https://www.preprints.org/manuscript/202008.0595/v1

16. Signus, J. "Anomalous datasets reveal metagenomic fabrication pipeline that further questions the legitimacy of RaTG13 genome and the associated Nature paper". viXra. https://vixra.org/abs/2010.0164

17. "Bat coronavirus RaTG13, complete genome", NCBI.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN996532.1 replaced by:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN996532

18. Cohen, J. (2020). "Wuhan coronavirus hunter Shi Zhengli speaks out". Science, 369, 487– 488. https://doi.org/10.1126/science.369.6503.487

19. Farmery, J. H. R., Smith, M. L., N. BioResource – Rare Diseases, & Lynch, A. G. (2018). Telomerecat: "A ploidy-agnostic method for estimating telomere length from whole genome sequencing data". Scientific Reports, 8, 1300. https://doi.org/10.1038/s41598-017-14403-y

20. Xiao, K., Zhai, J., Feng, Y., Zhou, N., Zhang, X., Zou, J., Li, N., Guo, Y., Li, X., Shen, X., Zhang, Z., Shu, F., Huang, W., Li, Y., Zhang, Z., Chen, R.-A., Wu, Y.-J., Peng, S.-M., Huang, M., … Shen, Y. (2020). "Isolation of SARS-CoV-2-related coronavirus from Malayan pangolins". Nature, 583, 286– 289. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2313-x

21. Chan, A. Y., & Zhan, H. S. (2020). Single source of pangolin CoVs with a near identical Spike RBD to SARS-CoV-2. BioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.07.07.184374

22. Hassanin, A. (2020). "The SARS-CoV-2-like virus found in captive pangolins from Guangdong should be better sequenced". BioRxiv. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.07.077016v1

23. Zhang, D. (2020). "The Pan-SL-CoV/GD sequences may be from contamination". Zenodo. http://doi.org/10.5281/zenodo.4395025

24. USRTK. (2020). "Altered datasets raise more questions about reliability of key studies on coronavirus origins". https://usrtk.org/biohazards-blog/altered-datasets-raise-more-questions-about-reliability-of-key-studies-on-coronavirus-origins/

25. Liu, P., Jiang, J. Z., Wan, X. F., Hua, Y., Li, L., Zhou, J., Wang, X., Hou, F., Chen, J., Zou, J., & Chen, J. (2020). "Are pangolins the intermediate host of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2)?" PLoS Pathog, 16, e100842. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008421 .

26. Lam, T. T. Y., Jia, N., Zhang, Y. W., Shum, M. H. H., Jiang, J. F., Zhu, H. C., Tong, Y.-G., Shi, Y.-X., Ni, X.-B., Liao, Y.-S., Li, W.-J., Jiang, B.-G., Wei, W., Yuan, T.-T., Zheng, K., Cui, X.-M., Li, J., Pei, G.-Q., Qiang, X., … Cao, W.-C. (2020). "Identifying SARS-CoV-2 related coronaviruses in Malayan pangolins". Nature, 583, 282– 285. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2169-0

27. Andersen, K. G., Rambaut, A., Lipkin, W. I., Holmes, E. C., & Garry, R. F. (2020). "The proximal origin of SARS-CoV-2". Nature Medicine, 26, 450– 452. https://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9

28. Frutos, R., Serra-Cobo, J., Chen, T., & Devaux, C. A. (2020). "COVID-19: Time to exonerate the pangolin from the transmission of SARS-CoV-2 to humans". Infection, Genetics and Evolution, 84, 104493. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104493

29. Lee, J., Hughes, T., Lee, M.-H., Field, H., Rovie-Ryan, J. J., Sitam, F. T., Sipangkui, S., Nathan, S. K. S. S., Ramirez, D., Kumar, S. V., Lasimbang, H., Epstein, J. H., Daszak, P. (2020). "No Evidence of Coronaviruses or Other Potentially Zoonotic Viruses in Sunda pangolins (Manis javanica) Entering the Wildlife Trade via Malaysia". EcoHealth, 17(3), 406– 418. http://doi.org/10.1007/s10393-020-01503-x

30. Piplani, S., Singh, P. K., Winkler, D. A., & Petrovsky, N. (2020). "In silico comparison of spike protein-ACE2 binding affinities across species; significance for the possible origin of the SARS-CoV-2 virus. arXiv. http://arxiv.org/abs/2005.06199

31. Wang, Y., Liu, M., & Gao, J. (2020). Enhanced receptor binding of SARS-CoV-2 through networks of hydrogen-bonding and hydrophobic interactions". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 117, 13967– 13974.

https://doi.org/10.1073/pnas.2008209117

32. Zhou, H., Ji, J., Chen, X., Bi, Y., Li, J., Hu, T., Song, H., Chen, Y., Cui, M., Zhang, Y., Hughes, A. C., Holmes, E. C., & Shi, W. (2021). "Identification of novel bat coronaviruses sheds light on the evolutionary origins of SARS-CoV-2 and related viruses". BioRxiv.

https://doi.org/10.1101/2021.03.08.434390

33. Chatzou, M., Magis, C., Chang, J. M., Kemena, C., Bussotti, G., Erb, I., & Notredame, C. (2015). "Multiple sequence alignment modeling: Methods and applications". Briefings in Bioinformatics, 17, 1009– 1023. https://doi.org/10.1093/bib/bbv099

34. Thompson, J., Higgins, D., & Gibson, T. (1994). "CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Research, 22, 4673– 4680.

https://doi.org/10.1093/nar/22.22.4673

Apel o otwartą debatę naukową na temat proksymalnego (zoonotycznego) pochodzenia SARS-CoV-2

Oryginalny tytuł: "An appeal for an open scientific debate about the proximal origin of SARS-CoV-2", opublikowany w maju 2021 w ResearchGate.

Autorzy: Jacques van Helden (1, 2,*) , Colin D. Butler (3), Bruno Canard (4), Guillaume Achaz (5 ,6), François Graner (7) , Rossana Segreto (8) , Yuri Deigin (9), Fabien Colombo (10) , Serge Morand (11) , Didier Casane (12 ,13), Dan Sirotkin (14), Karl Sirotkin (14), Etienne Decroly (4, *), José Halloy (15, *).

1. CNRS (Centre national de la recherche scientifique), Institut Français de Bioinformatique, IFB-core, UMS 3601, Evry, France

2. Aix-Marseille Univ, Inserm, laboratoire Theory and approaches of genome complexity (TAGC), Marseille, France; ORCID: 0000-0002-8799-8584

3. National Centre for Epidemiology and Population Health, Australian National University, Canberra, Australia

4. Aix-Marseille Univ, CNRS, UMR 7257, AFMB, Case 925, 163 Avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09, France. ORCID: 0000-0002-6046-024X

5. Eco-Anthropologie (UMR7206 Université de Paris-CNRS-MNHN), Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris, France

6. Center for Interdisciplinary Research in Biology (UMR7142 Collège de France-CNRS-INSERM), Collège de France, Paris, France

7. MSC, Université de Paris, CNRS UMR 7057, 10 rue Alice Domon et Léonie Duquet, 75205 Paris Cedex 13, France

8. Department of Microbiology, University of Innsbruck, Austria

9. Youthereum Genetics Inc., Toronto, Canada.

10. Université Bordeaux Montaigne, Mediation, Information, Communication, Art (MICA, EA 4426), 10 esplanade des Antilles, Pessac, France.

11. Montpellier Université, CNRS, Institut des Sciences de l'Évolution (ISEM), 34290 Montpellier, France, ORCID: 0000-0003-3986-7659

12. Université Paris-Saclay, CNRS, IRD, UMR Évolution, Génomes, Comportement et Écologie, 91198, Gif-sur-Yvette, France

13. Université de Paris, UFR Sciences du Vivant, F-75013 Paris, France

14. Karl Sirotkin LLC. ORCID: 0000-0002-9685-0338

15. Université de Paris, LIED, CNRS UMR 8236, 85 bd Saint-Germain, 75006 Paris, France. ORCID: 0000-0003-1555-2484

* Autorzy korespondenci.

Streszczenie

Rok po wybuchu pandemii COVID-19 wyjaśnienie pochodzenia wirusa SARS-CoV-2 wciąż umyka ludzkości. Wczesne publikacje stanowczo stwierdzały, żeewentualność że wirus jest pochodzenia naturalnego, a ewentualność że mógł on wyciec z laboratorium, w większości kolejnych publikacji została odrzucona. Jednakże na podstawie ponownej analizy pierwotnych argumentów, wzmocnionej obecną wiedzą na temat tego wirusa, w niniejszym dokumencie wykazujemy, że teoria o naturalnym jego pochodzeniu nie jest poparte rozstrzygającymi argumentami, a pochodzenie laboratoryjne nie może być formalnie odrzucone. Wzywamy do otwarcia łam czasopism naukowych do racjonalnej, opartej na dowodach oraz pozbawionej uprzedzeń, oceny wszystkich rozsądnych hipotez, dotyczących pochodzenia wirusa. Opowiadamy się za tym, aby debata ta odbywała się na łamach renomowanych czasopism naukowych, a nie pozostawiona była mediom społecznościowym i gazetom.

Punkt widzenia

19 lutego 2020 roku, trzy tygodnie po publikacji genomu SARS-CoV-2 1), dwudziestu siedmiu badaczy podpisało „Oświadczenie wspierające naukowców, specjalistów zdrowia publicznego i medycyny z Chin walczących z COVID-19”, opublikowane w „The Lancet” 2). Zajęli oni autorytatywne stanowisko na temat pochodzenia nowego koronawirusa, stojącego za wybuchem pandemii: „Badacze z wielu krajów opublikowali i przeanalizowali genomy czynnika sprawczego SARS-CoV-2, i zdecydowanie stwierdzają, że ten koronawirus powstał w dzikiej przyrodzie”. Od tamtej pory oświadczenie to zebrało dalsze 23000 dodatkowych podpisów, a w międzynarodowej prasie zostało wykorzystane jako dowód, że SARS-CoV-2 pojawił się jako naturalna choroba odzwierzęca.

Dzielimy irytację naszych kolegów z powodu różnych bezpodstawnych teorii rozprzestrzeniających się w mediach społecznych, które wydawały się mieć na celu zwiększenie napięć geopolitycznych na świecie. Jednak na podstawie aktualnej literatury naukowej, uzupełnionej naszą własną analizą genomów koronawirusa oraz jego białek 3–5) uważamy, że obecnie nie ma przekonujących dowodów, aby ostatecznie rozstrzygać między jego całkowicie „naturalnym” pochodzeniem (tj. wirus, który wyewoluował i został przeniesiony na ludzi wyłącznie przez kontakt ze zwierzętami dzikimi lub hodowlanymi), a pochodzenirm „laboratoryjnym” (które może obejmować jedno lub więcej etapów, takich jak transport próbek zwierzęcych do Wuhan, ewolucja wirusa, przypadek wskaźnikowy występujący poprzez eksponowanie na wirusa w laboratorium, przypadkowy wyciek z laboratorium, wadliwy sprzęt do autoklawowania lub jakiekolwiek inne inna możliwa droga ucieczki ...).

Spośród dziewięciu odniesień cytowanych w oświadczeniu na poparcie hipotezy o naturalnym pochodzeniu SARS-CoV-2 , aż osiem składa się z drzew, wykazujących związki filogenetyczne między SARS-CoV-2 a innymi koronawirusami. Należy dokonać rozróżnienia między ogólnym pochodzeniem, a proksymalnym pochodzeniem wirusa, to jest ostatnim etapem łańcucha transmisyjnego - z pierwotnego rezerwuaru zwierzęcego (przypuszczalnie nietoperzy) do ludzi. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą fakt, że czynnik sprawczy COVID-19 pochodzi od naturalnych wirusów, nie był przez nikogo kwestionowany, ale to dystalne pochodzenie nie wyjaśnia, jak to się stało, że był on w stanie zarażać ludzi. Ten ostatni krok jest wciąż nieznany, ponieważ najbliższy wirus zwierzęcy, jakim dysponujemy (RaTG13) wykazuje 4% różnicę z SARS-CoV-2, czyli dystans genetyczny, który jak się szacuje, odpowiada okresowi 4 do 7 dekad ewolucyjnej dywergencji 6). Na podstawie dowodów molekularnych łuskowce nie są już uważane za wiarygodnego gospodarza (nosiciela) pośredniego 7–10). W związku z tym nadal musimy prześledzić zwierzęcych pośredników między rezerwuarem nietoperzy, zlokalizować miejsca transmisji, scharakteryzować szczepy wirusa, odtworzyć przebieg epidemii od pierwszych pacjentów z COVID-19, a na koniec zrozumieć ostateczne warunki przejścia wirusa ze zwierząt na ludzi.

Pochodzenie proksymalne (zoonotyczne) zostało w formie stanowczej przedstawione w jednym z opracowań, przywołanych w czasopiśmie „Lancet” – przeddruk Andersen et al., opublikowany później w „Nature Medicine”, w kwietniu 2020 roku 11). Artykuł ten stał się wysoce wpływowy - w ciągu 9 miesięcy był cytowany w 2000 publikacji naukowych, a zdecydowana większość naukowców, w tym wielu z nas, początkowo przyjęła za pewnik, że ten nowy koronawirus jest pochodzenia naturalnego. Jednakże po ponownej analizie zdaliśmy sobie sprawę, że nadal brakuje rozstrzygającego dowodu na proksymalne (odzwierzęce) pochodzenie wirusa. Pierwotną metodą rozumowania, przyjętą w wielu późniejszych pracach, było zestawienie dwóch przeciwstawnych możliwości: pochodzenie naturalne kontra „konstrukt laboratoryjny lub celowo wyprodukowany wirus". Przeciwko ostatniej ewentualności przedstawiono dwa główne argumenty: (1) specyficzne mutacje, które nadają im szczególne powinowactwo do białka kolca SARS-CoV-2, były nieznane przed pojawieniem się COVID-19, a zatem nie można było go zaprojektować; (2) genom SARS-CoV-2 nie ma dowodów do inżynierii odwrotnej (na przykład wcześniej używanego szkieletu wirusa). Hipoteza konstrukcji laboratoryjnej wirusa została w ten sposób odrzucona, pozostawiając naturalne proksymalne pochodzenie jako jedyną możliwość.

Jednak to rozumowanie obarczone jest błędem logicznym. Udowodnienie hipotezy przez odrzucenie jej alternatywy jest ważne tylko wtedy, gdy obie hipotezy wzajemnie się wykluczają i obejmują wszystkie wyobrażalne możliwości. W tym przypadku warunki te nie są spełnione, ponieważ możliwe są inne mechanizmy, na przykład eksperymenty z seryjnymi pasażami 12), które polegają na testowaniu i mierzeniu zdolności wirusa do infekowania różnych modeli zwierzęcych lub hodowanych komórek. Takie eksperymenty polegają na sztucznej selekcji losowych mutacji, które zwiększają przystosowanie wirusa do nowego gospodarza, co skutkuje szybką ewolucją sekwencji genomowych.

Podobnie jak w wielu laboratoriach wirusologicznych, eksperymenty pasażowe są rutynowo przeprowadzane w Instytucie Wirusologii Wuhan (WIV) 13-15), zgodnie z ich misją zbierania i monitorowania szczepów wirusowych o potencjale epidemicznym u ludzi. Andersen odrzuca selekcję podczas przejścia argumentując, że byłaby to mniej oszczędne niż pochodzenie od łuskowców. Jednak hipoteza łuskowca została już od tamtego czasu porzucona 7-10). Jeśli chodzi o hipotezę konstruktu laboratoryjnego, brak dowodów nie jest dowodem na ich brak, a genom wirusa może być skonstruowany z nieopublikowanym jeszcze szkieletem. Również oczekiwanie znalezienia śladów inżynierii w sekwencjach nie uwzględnia bez zarzutu funkcjonujących technologii, stosowanych obecnie do syntezy kwasów nukleinowych, które istnieją od około 20 lat 16).

Eksperymenty z udziałem wirusów chorobotwórczych wymagają bardzo bezpiecznych warunków laboratoryjnych 17,18). Istnieje jednak wiele dobrze udokumentowanych przypadków ucieczki patogenów z laboratoriów, w tym wirusów 12,19-22). Ten scenariusz został a priori odrzucony w lutowym oświadczeniu: „Jesteśmy razem, aby zdecydowanie potępić teorie spiskowe sugerujące, że COVID-19 nie ma naturalnego pochodzenia” 2). My, podobnie jak autorzy z „The Lancet”, potępiamy teorie spiskowe. Jednak wypadek nie jest spiskiem i uważamy, że scenariusze dotyczące potencjalnego wypadku laboratoryjnego powinny być rygorystycznie oceniane wraz z innymi hipotezami. Co więcej, właśnie dlatego, że rzeczywiste teorie spiskowe tak szybko rozprzestrzeniają się w mediach społecznościowych i za pośrednictwem niektórych polityków, powinniśmy, jako społeczność naukowa, oceniać wszystkie hipotezy w sposób racjonalny. Musimy zważyć ich prawdopodobieństwo, oparte na faktach i dowodach, pozbawionych spekulacji dotyczących rzekomych intencji politycznych. Podejście to wydaje się spójne z poglądami przedstawionymi przy konkluzji oświadczenia „Lancet” - „w celu promowania dowodów naukowych i jedności ponad dezinformacją i przypuszczeniami”. Małe słowo robi tutaj różnicę - kwestia naukowa nigdy nie została rozwiązana i nigdy nie należy się do niej podchodzić prosząc naukowców o promowanie jedności (poglądów). Nauka z definicji bada i obejmuje alternatywne hipotezy, sprzeczne argumenty, weryfikację, obalanie, a nawet kontrowersje. Odejście od tej zasady grozi ustanowieniem dogmatów i porzuceniem nauki.

Niestety, jednolity pogląd promowany w oświadczeniu w „Lancet”, został do tej pory, z nielicznymi wyjątkami, powszechnie przyjęty 3,4, 12, 23–25). Naukowe oceny alternatywnych hipotez dotyczących pochodzenia COVID-19 są jak dotąd nieobecne w najbardziej znanych czasopismach naukowych. Luka ta może nawet podsycać teorie spiskowe. Zamiast tego społeczność naukowa powinna przenieść tę debatę na miejsce, do którego należy - na kolumny renomowanych czasopism naukowych 26). Oparta na dowodach, niezależna i wolna od uprzedzeń ocena wszystkich uzasadnionych scenariuszy pochodzenia będzie wymagała zebrania próbek i danych we wszystkich potencjalnie istotnych miejscach, w tym w miejscach i farmach dzikich zwierząt (zgodnie z planem misji WHO), ale także w szpitalach i laboratoriach. Wysiłek ten ma kluczowe znaczenie nie tylko dla rozwiązania wielu pytań, na które obecnie nie ma odpowiedzi i wyjaśnienia przyczyn pandemii, ale także dla podjęcia odpowiednich działań zapobiegawczych.

Literatura źródłowa

1. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, et al. "A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin". Nature 2020; 579: 270–3. 

2. Calisher C, Carroll D, Colwell R, et al. "Statement in support of the scientists, public health professionals, and medical professionals of China combatting COVID-19". The Lancet 2020; 395: e42–3. 

3. Segreto R, Deigin Y. "The genetic structure of SARS-CoV-2 does not rule out a laboratory origin: SARS-COV-2 chimeric structure and furin cleavage site might be the result of genetic manipulation". BioEssays 2020; : 2000240. 

4. Sallard E, Halloy J, Casane D, Decroly É, van Helden J. "Tracing the origins of SARS-COV-2 in coronavirus phylogenies". Environmental Chemistry Letters 2021; in press. 

5. Sallard E, Halloy J, Casane D, Decroly E, van Helden J. Tracing the origins of SARS-CoV-2 in coronavirus phylogenies. Med Sci (Paris) 2020; 36: 783–96. 

6. Sironi M, Hasnain S. E., Rosenthal B, et al. "SARS-CoV-2 and COVID-19: A genetic, epidemiological, and evolutionary perspective". Infection, Genetics and Evolution 2020; 84: 104384. 

7. Lee J, Hughes T, Lee M-H, et al. "No Evidence of Coronaviruses or Other Potentially Zoonotic Viruses in Sunda pangolins (Manis javanica) Entering the Wildlife Trade via Malaysia". EcoHealth 2020; published online Nov 23. DOI:10.1007/s10393-020-01503-x. 

8. Choo SW, Zhou J, Tian X, et al. "Are pangolins scapegoats of the COVID-19 outbreak-CoV transmission and pathology evidence?" Conservation Letters 2020; 13. DOI:10.1111/conl.12754. 

9. Frutos R, Serra-Cobo J, Chen T, Devaux C. A. "COVID-19: Time to exonerate the pangolin from the transmission of SARS-CoV-2 to humans". Infection, Genetics and Evolution 2020; 84: 104493. 

10. WHO-convened "Global Study of the Origins of SARS-CoV-2", website (dostęp 20-12-2020): https://www.who.int/publications/m/item/who-convened-global-study-of-the-origins-of-sars-cov2 . 

11. Andersen K. G., Rambaut A, Lipkin W. I., Holmes E. C., Garry R. F. "The proximal origin of SARS-CoV-2". Nature Medicine 2020; 26: 450–2. 

12. Sirotkin K, Sirotkin D. "Might SARS-CoV-2 Have Arisen via Serial Passage through an Animal Host or Cell Culture?: A potential explanation for much of the novel coronavirus’ distinctive genome". BioEssays 2020; : 2000091. 

13. Hu B, Zeng L-P, Yang X-L, et al. "Discovery of a rich gene pool of bat SARS-related coronaviruses provides new insights into the origin of SARS coronavirus". PLOS Pathogens 2017; 13: e1006698. 

14. Ge X-Y, Li J-L, Yang X-L, et al. "Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor". Nature 2013; 503: 535–8. 

15. Yang X-L, Hu B, Wang B, et al. "Isolation and Characterization of a Novel Bat Coronavirus Closely Related to the Direct Progenitor of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus". Journal of Medical Virology 2016; 90: 3253–6. 

16. Yount B, Denison M. R., Weiss S. R., Baric R. S. "Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59". Journal of Medical Virology 2002; 76: 11065–78. 

17. Moritz RL, Berger K. M., Owen B. R., Gillum D. R. "Promoting biosecurity by professionalizing biosecurity". Science 2020; 367: 856–8. 

18. Xia H, Huang Y, Ma H, et al. "Biosafety Level 4 Laboratory User Training Program, China". Emerging Infectious Diseases journal 2019; 25. DOI:10.3201/eid2505.180220.

19. Sewell D. L. "Laboratory-associated infections and biosafety". Clinical Microbiology Reviews 1995; 8: 389–405. 

20. Heymann D. L., Aylward R. B., Wolff C. "Dangerous pathogens in the laboratory: from smallpox to today’s SARS setbacks and tomorrow’s polio-free world". The Lancet 2004; 363: 1566–8. 

21. Siengsanan-Lamont J, Blacksell S. D. "A Review of Laboratory-Acquired Infections in the Asia-Pacific: Understanding Risk and the Need for Improved Biosafety for Veterinary and Zoonotic Diseases". Tropical Medicine and Infectious Disease 2018; 3: 36. 

22. Klotz L. C., Sylvester EJ. "The Consequences of a Lab Escape of a Potential Pandemic Pathogen". Front Public Health 2014; 2. DOI:10.3389/fpubh.2014.00116. 4/5 

23. Rahalkar M. C., Bahulikar RA. "Lethal Pneumonia Cases in Mojiang Miners (2012) and the Mineshaft Could Provide Important Clues to the Origin of SARS-CoV-2". Front Public Health 2020; 8: 581569. 

24. Seyran M, Pizzol D, Adadi P, et al. "Questions concerning the proximal origin of SARS-CoV-2". Journal of Medical Virology 2020; : jmv.26478.

25. Butler C. D. "Plagues, Pandemics, Health Security, and the War on Nature". Journal of Human Security 2020; 16: 53–7. 

26. Relman D. A. "Opinion: To stop the next pandemic, we need to unravel the origins of COVID-19". Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 2020; 117: 29246–8.