Oryginalny tytuł: "Bat Severe Acute Respiratory Syndrome-Like Coronavirus WIV1 Encodes an Extra Accessory Protein, ORFX, Involved in Modulation of the Host Immune Response".
Autorzy: Lei-Ping Zeng a) Yu-Tao Gao a), Xing-Yi Ge a), Qian Zhang a), Cheng Peng a), Xing-Lou Yang a), Bing Tan a), Jing Chen a), Aleksei A. Chmura b), Peter Daszak b), Zheng-Li Shia a).
a) Key Laboratory of Special Pathogens, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.
b) EcoHealth Alliance, New York, New York, USA
Data publikacji: 11 maja 2016, "Journal of Virology".
[Wybrane przez autora bloga fragmenty pracy, patrz niżej UWAGI]
STRESZCZENIE
Nietoperze są nosicielami koronawirusów podobnych do ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS) (SL-CoV), od których - jak się uważa, wywodził się czynnik sprawczy pandemii SARS w latach 2002-2003. Jednak pomimo faktu, że u nietoperzy wykryto dużą liczbę genetycznie zróżnicowanych sekwencji SL-CoV, tylko dwa szczepy (nazwane WIV1 i WIV16) zostały z powodzeniem wyhodowane in vitro. Te dwa szczepy różnią się od SARS-CoV jedynie tym, że zawierają dodatkową otwartą ramkę odczytu (ORF), nazwaną ORFX, pomiędzy ORF6 i ORF7, która nie ma homologii z żadną ze znanych sekwencji białkowych.
W badaniu tym skonstruowaliśmy klon cDNA pełnej długości SL-CoV WIV1 (rWIV1), mutanta delecyjnego ORFX (rWIV1-λX) i mutanta eksprymującego zielone białko fluorescencyjne (GFP) (rWIV1-GFP-λX).
Hybrydyzacja techniką Northern i mikroskopia fluorescencyjna wskazują, że ORFX ulegał ekspresji podczas infekcji WIV1. Test infekcji wirusowej wykazał, że rWIV1-λX replikuje się równie wydajnie jak rWIV1 w komórkach Vero E6, Calu-3 i HeLa-hACE2. Dalsze badania wykazały, że ORFX może hamować produkcję interferonu i aktywować kompleks białkowy NF-κB. Nasze wyniki pokazują po raz pierwszy, że unikalny ORFX w szczepie WIV1 jest funkcjonalnym genem obejmującym modulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale nie jest niezbędny do replikacji wirusa in vitro.
ZNACZENIE
Nietoperze są nosicielami genetycznie zróżnicowanych koronawirusów podobnych do SARS (SL-CoV), a niektóre z nich mają potencjał do przenoszenia międzygatunkowego. W genomach dwóch (WIV1 i -16) niedawno wyizolowanych szczepów nietoperza SL-CoV, zidentyfikowano unikalną otwartą ramkę odczytu (ORFX). Dlatego kluczowe będzie wyjaśnienie, czy i w jaki sposób białko to przyczynia się do zjadliwości podczas infekcji wirusowej.
Wykazaliśmy tutaj, że unikalny ORFX jest funkcjonalnym genem, który bierze udział w modulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale nie jest niezbędny do replikacji wirusa in vitro. Nasze wyniki dostarczają ważnych informacji do dalszej eksploracji funkcji ORFX w przyszłości. Ponadto skonstruowany przez nas system genetyki odwrotnej będzie pomocny w badaniu patogenezy tej grupy wirusów oraz w opracowaniu środków terapeutycznych do przyszłej kontroli pojawiających się infekcji podobnych do SARS.
Koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) jest odzwierzęcym patogenem, który spowodował pandemię SARS w latach 2002-2003, która powstała w Chinach (1). Od tego czasu genetycznie zróżnicowane koronawirusy podobne do SARS (SL-CoV) były zgłaszane u nietoperzy w Chinach, Europie i Afryce (2–11), co wskazuje na szerokie geograficzne rozmieszczenie tej grupy wirusów. Jednak większość SL-CoV nietoperzy została zidentyfikowana tylko przez sekwencje i nie została w pełni scharakteryzowana ze względu na brak hodowanych wirusów. W związku z tym ich potencjał przenoszenia się i prawdopodobna patogeneza u zwierząt domowych i ludzi pozostaje niezbadany.
WIV1 i WIV16 to dwa niedawno zidentyfikowane szczepy SL-CoV o wysokim podobieństwie genomowym do ludzkiego SARS-CoV. Te dwa szczepy z powodzeniem hodowano in vitro i wykazano, że wykorzystują tę samą cząsteczkę (enzym konwertujący angiotensynę [ACE 2]) do wejścia do komórki co SARS-CoV (2, 10). Ostatnio wykazano, że inny szczep nietoperza SL-CoV, SHC014, wykorzystuje ludzki ACE 2 przez konstruowanie zakaźnego klonu cDNA (12). Ponadto eksperymenty na zwierzętach wykazały, że SL-CoV WIV1 i SHC014 mogą się wydajnie replikować i powodować niską patogenezę u transgenicznych myszy ACE 2 (12, 13). Fakt, że natywne szczepy nietoperzowe SL-CoV mogą wykorzystywać ludzki ACE 2 bez żadnych mutacji, wskazuje na wysokie ryzyko przenoszenia międzygatunkowego tych i podobnych koronawirusów, które mogą występować w naturalnych rezerwuarach.
[...]
MATERIAŁY I METODY [tylko tytuły akapitów – mój przypis]: Wirus i komórki; Plazmidy; Testy infekcji wirusowej; Klonowanie cDNA szczepu WIV1; Strategia modyfikacji pBeloBAC11 [pBeloBAC11 to wektor do klonowania plazmidu E. coli zaprojektowany do konstrukcji sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) – mój przypis]; Konstruowanie zakaźnych klonów sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) szczepu WIV1; Konstruowanie mutantów szczepu WIV1; Transfekcja zakaźnych klonów BAC szczepu WIV1; Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP); Analiza hybrydyzacji Northern; RT-PCR transkryptów zawierających lidera; Lokalizacja subkomórkowa ORFX; Testy lucyferazy i ilościowa PCR; Test translokacji IRF3; Ilościowa ocena ekspresji mRNA cytokin w zakażonych komórkach Calu-3; Test wrażliwości na interferon IFN-β; Statystyki.
WYNIKI [tylko tytuły akapitów – mój przypis]: Strategia budowy zakaźnego BAC szczepu WIV1; Ratowanie zrekombinowanych wirusów; ORFX jest funkcjonalnym genem, który nie jest niezbędny do replikacji wirusa; Białko ORFX hamuje produkcję interferonu IFN-β; Mutant delecyjny ORFX wykazuje zwiększoną wrażliwość na interferon IFN-β; Białko ORFX aktywuje kompleks białkowy NF-κB.
DYSKUSJA
W badaniu tym opracowaliśmy szybką i oszczędną kosztownie metodę odwrotnej genetyki koronawirusów poprzez połączenie dwóch podejść opracowanych przez innych (29, 30). Nasza metoda pozwala dzielić genomy koronawirusów na wiele fragmentów i w jednym etapie wstawiać do plazmidu BAC. Rekombinowane wirusy mogą być następnie skutecznie uratowane przez bezpośrednią transfekcję konstruktów BAC. Ponieważ genomy można podzielić na wiele krótkich fragmentów, można łatwo wprowadzić do osobnika mutacje w poszczególnych fragmentach (31).[ …] W naszym badaniu odkryliśmy również za pomocą podwójnego testu lucyferazy, że nadekspresja ORFX może aktywować kompleks białkowy NF-κB (ryc. 6A). Ponadto, poziom TNFα-mRNA indukowany przez rekombinowany wirus typu dzikiego był znacząco wyższy niż indukowany przez mutanta delecyjnego ORFX, ale tylko w późnym stadium infekcji (Fig. 6E). Wyniki te wskazują, że ORFX uczestniczy również w aktywacji NF-κB. Zauważyliśmy, że aktywność hamowania IFN przez ORFX nie była zależna od dawki i zmniejszała się, gdy było więcej ekspresji ORFX. […] Należy zauważyć, że systemy wykrywania IFN i NF-κB zastosowane w tym badaniu, pochodziły i były stosowane w komórkach ludzkich. Ponieważ wrodzony układ odpornościowy nietoperzy jest szczególny i prawdopodobnie pod pewnymi względami niedostateczny w porównaniu z układem ludzkim (34), interesujące będzie przeprowadzenie tych samych badań na komórkach nietoperzy w celu ustalenia, czy białko ORFX ma takie same profile, jak te obserwowane w ludzkim systemie komórkowym. Opracowanie różnych linii komórkowych nietoperza (podkowca) Rhinolophus, który jest żywicielem rezerwuarowym SL-CoV, ułatwi te badania w przyszłości.
PODZIĘKOWANIA
[…] Praca ta została sfinansowana wspólnie przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81290341, 31321001 i 81401672) oraz Narodowe Instytuty Zdrowia USA (NIAID R01AI110964).
INFORMACJE DOTYCZĄCE FINANSOWANIA
Praca ta, w tym wysiłki Zheng-Li Shi, została sfinansowana przez Narodową Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC – National Natural Science Foundation of China) (81290341 i 31321001). Praca ta, w tym starania Piotra Daszaka, została sfinansowana przez Fundację na rzecz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIAID R01AI110964). Ta praca, w tym starania Xing-Yi Ge, została sfinansowana przez Narodową Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC) (81401672).
LITERATURA
1. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, Nicholls J, Yee WKS, Yan WW, Cheung MT, Cheng VCC, Chan KH, Tsang DNC, Yung RWH, Ng TK, Yuen KY. 2003. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 361:1319–1325.
http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(03)13077-2.
2. Ge XY, Li JL, Yang XL, Chmura AA, Zhu G, Epstein JH, Mazet JK, Hu B, Zhang W, Peng C, Zhang YJ, Luo CM, Tan B, Wang N, Zhu Y, Crameri G, Zhang SY, Wang LF, Daszak P, Shi ZL. 2013. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503:535–538. http://dx.doi.org/10.1038/nature12711.
3. Yuan J, Hon CC, Li Y, Wang D, Xu G, Zhang H, Zhou P, Poon LL, Lam TT, Leung FC, Shi Z. 2010. Intraspecies diversity of SARS-like coronaviruses in Rhinolophus sinicus and its implications for the origin of SARS coronaviruses in humans. J Gen Virol 91:1058–1062. http://dx.doi.org/10.1099/vir.0.016378-0.
4. Drexler JF, Gloza-Rausch F, Glende J, Corman VM, Muth D, Goettsche M, Seebens A, Niedrig M, Pfefferle S, Yordanov S, Zhelyazkov L, Hermanns U, Vallo P, Lukashev A, Muller MA, Deng H, Herrler G, Drosten C. 2010. Genomic characterization of severe acute respiratory syndrome-related coronavirus in European bats and classification of coronaviruses based on partial RNA-dependent RNA
polymerase gene sequences. J Virol 84:11336 –11349. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.00650-10.
5. Tong S, Conrardy C, Ruone S, Kuzmin IV, Guo X, Tao Y, Niezgoda M, Haynes L, Agwanda B, Breiman RF, Anderson LJ, Rupprecht CE. 2009. Detection of novel SARS-like and other coronaviruses in bats from Kenya. Emerg Infect Dis 15:482–485. http://dx.doi.org/10.3201/eid1503.081013.
6. Lau SKP, Woo PCY, Li KSM, Huang Y, Tsoi HW, Wong BHL, Wong SSY, Leung SY, Chan KH, Yuen KY. 2005. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc Natl Acad Sci U S A 102:14040 –14045. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0506735102.
7. Li WH, Zhang CS, Sui JH, Kuhn JH, Moore MJ, Luo SW, Wong SK, Huang IC, Xu KM, Vasilieva N, Murakami A, He YQ, Marasco WA, Guan Y, Choe HY, Farzan M. 2005. Receptor and viral determinants of SARS-coronavirus adaptation to human ACE2. EMBO J 24:1634–1643.
http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600640.
8. He B, Zhang Y, Xu L, Yang W, Yang F, Feng Y, Xia L, Zhou J, Zhen W, Feng Y, Guo H, Zhang H, Tu C. 2014. Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome-like coronavirus from bats in China. J Virol 88:7070–7082. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.00631-14.
9. Ren W, Li W, Yu M, Hao P, Zhang Y, Zhou P, Zhang S, Zhao G, Zhong Y, Wang S, Wang LF, Shi Z. 2006. Full-length genome sequences of two SARS-like coronaviruses in horseshoe bats and genetic variation analysis. J Gen Virol 87:3355–3359. http://dx.doi.org/10.1099/vir.0.82220-0.
10. Yang XL, Hu B, Wang B, Wang MN, Zhang Q, Zhang W, Wu LJ, Ge XY, Zhang YZ, Daszak P, Wang LF, Shi ZL. 2015. Isolation and characterization of a novel bat coronavirus closely related to the direct progenitor of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Virol 90:3253–3256.
11. Lau SK, Li KS, Huang Y, Shek CT, Tse H, Wang M, Choi GK, Xu H, Lam CS, Guo R, Chan KH, Zheng BJ, Woo PC, Yuen KY. 2010. Ecoepidemiology and complete genome comparison of different strains of severe acute respiratory syndrome-related Rhinolophus bat coronavirus in China reveal bats as a reservoir for acute, self-limiting infection that allows recombination events. J Virol 84:2808–2819. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.02219-09.
12. Menachery VD, Yount BL, Jr, Debbink K, Agnihothram S, Gralinski LE, Plante JA, Graham RL, Scobey T, Ge XY, Donaldson EF, Randell SH, Lanzavecchia A, Marasco WA, Shi ZL, Baric RS. 2015. A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med 21:1508–1513. http://dx.doi.org/10.1038/nm.3985.
13. Menachery VD, Yount BL, Jr, Sims AC, Debbink K, Agnihothram SS, Gralinski LE, Graham RL, Scobey T, Plante JA, Royal SR, Swanstrom J, Sheahan TP, Pickles RJ, Corti D, Randell SH, Lanzavecchia A, Marasco WA, Baric RS. 2016. SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proc Natl Acad Sci U S A http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1517719113.
14. de Groot R, Baker S, Baric R, Enjuanes L, Gorbalenya A, Holmes K, Perlman S, Poon L, Rottier P, Talbot P, Woo P, Ziebuhr J. 2012. Family Coronaviridae, p 806–828. In King A, Adams M, Cartens E, Lefkowitz E (ed), Virus taxonomy: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA.
15. Woo PC, Lau SK, Lam CS, Lau CC, Tsang AK, Lau JH, Bai R, Teng JL, Tsang CC, Wang M, Zheng BJ, Chan KH, Yuen KY. 2012. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus. J Virol 86:3995–4008. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.06540-11.
16. Rota PA, Oberste MS, Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Penaranda S, Bankamp B, Maher K, Chen MH, Tong SX, Tamin A, Lowe L, Frace M, DeRisi JL, Chen Q, Wang D, Erdman DD, Peret TCT, Burns C, Ksiazek TG, Rollin PE, Sanchez A, Liffick S, Holloway B, Limor J, McCaustland K, Olsen-Rasmussen M, Fouchier R, Gunther S, Osterhaus ADME, Drosten C, Pallansch MA, Anderson LJ, Bellini WJ. 2003. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science 300:1394–1399. http://dx.doi.org/10.1126/science.1085952.
17. Li WD, Shi ZL, Yu M, Ren WZ, Smith C, Epstein JH, Wang HZ, Crameri G, Hu ZH, Zhang HJ, Zhang JH, McEachern J, Field H, Daszak P, Eaton BT, Zhang SY, Wang LF. 2005. Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses. Science 310:676–679. http://dx.doi.org/10.1126/science.1118391.
18. Yount B, Roberts RS, Sims AC, Deming D, Frieman MB, Sparks J, Denison MR, Davis N, Baric RS. 2005. Severe acute respiratory syndrome coronavirus group-specific open reading frames encode nonessential functions for replication in cell cultures and mice. J Virol 79:14909–14922. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.79.23.14909-14922.2005.
19. Liu DX, Fung TS, Chong KK-L, Shukla A, Hilgenfeld R. 2014. Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses. Antiviral Res 109:97–109. http://dx.doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.06.013.
20. Kopecky-Bromberg SA, Martinez-Sobrido L, Frieman M, Baric RA, Palese P. 2007. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J Virol 81:548–557. http://dx.doi.org/10.1128/JVI .01782-06.
21. Minakshi R, Padhan K, Rani M, Khan N, Ahmad F, Jameel S. 2009. The SARS coronavirus 3a protein causes endoplasmic reticulum stress and induces ligand-independent downregulation of the type 1 interferon receptor. PLoS One 4:e8342. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0008342.
22. Obitsu S, Ahmed N, Nishitsuji H, Hasegawa A, Nakahama K, Morita I, Nishigaki K, Hayashi T, Masuda T, Kannagi M. 2009. Potential enhancement of osteoclastogenesis by severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a/X1 protein. Arch Virol 154:1457–1464. http://dx.doi.org/10.1007/s00705-009-0472-z.
23. Kanzawa N, Nishigaki K, Hayashi T, Ishii Y, Furukawa S, Niiro A, Yasui F, Kohara M, Morita K, Matsushima K, Le MQ, Masuda T, Kannagi M. 2006. Augmentation of chemokine production by severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a/X1 and 7a/X4 proteins through NF-kappaB activation. FEBS Lett 580:6807–6812. http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2006.11.046.
24. Zhou P, Li H, Wang H, Wang LF, Shi Z. 2012. Bat severe acute respiratory syndrome-like coronavirus ORF3b homologues display different interferon antagonist activities. J Gen Virol 93:275–281. http://dx.doi.org /10.1099/vir.0.033589-0.
25. Ren W, Qu X, Li W, Han Z, Yu M, Zhou P, Zhang SY, Wang LF, Deng H, Shi Z. 2008. Difference in receptor usage between severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and SARS-like coronavirus of bat origin. J Virol 82:1899–1907. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.01085-07.
26. Perrotta AT, Been MD. 1991. A pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA. Nature 350:434–436. http://dx.doi.org/10.1038/350434a0.
27. Santoro MG, Rossi A, Amici C. 2003. NF-kappaB and virus infection: who controls whom. EMBO J 22:2552–2560. http://dx.doi.org/10.1093/emboj/cdg267.
28. DeDiego ML, Nieto-Torres JL, Jimenez-Guardeño JM, Regla-Nava JA, Castaño-Rodriguez C, Fernandez-Delgado R, Usera F, Enjuanes L. 2014. Coronavirus virulence genes with main focus on SARS-CoV envelope gene. Virus Res 194:124–137. http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.07.024.
29. Almazan F, Gonzalez JM, Penzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Duran J, Enjuanes L. 2000. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A 97:5516–5521. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.97.10.5516.
30. Yount B, Curtis KM, Baric RS. 2000. Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J Virol 74:10600–10611. http://dx.doi.org/10.1128/JVI.74.22.10600-10611.2000.
31. Donaldson EF, Sims AC, Baric RS. 2008. Systematic assembly and genetic manipulation of the mouse hepatitis virus A59 genome. Methods Mol Biol 454:293–315. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-59745-181-9_21.
32. Fung TS, Liu DX. 2014. Coronavirus infection, ER stress, apoptosis and innate immunity. Front Microbiol 5:296. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2014.00296.
33. Chaudhari N, Talwar P, Parimisetty A, Lefebvre d’ Hellencourt C, Ravanan P. 2014. A molecular web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress. Front Cell Neurosci 8:213. http://dx.doi.org/10.3389/fncel.2014.00213.
34. Baker ML, Schountz T, Wang LF. 2013. Antiviral immune responses of bats: a review. Zoonoses Public Health 60:104–116. http://dx.doi.org/10.1111/j.1863-2378.2012.01528.x.
UWAGI
Autor bloga zwraca uwagę, że w powyższa praca powstała w ramach realizacji w latach 2014-2020 amerykańsko-chińskiego projektu badawczego, pod numerem R01AI110964, zatytułowanego "ZROZUMIENIE RYZYKA POJAWIENIA SIĘ KORONAWIRUSA NIETOPERZY" (UNDERSTANDING THE RISK OF BAT CORONAVIRUS EMERGENCE). Nadzór merytoryczny nad projektem należał do Petera Daszaka z EchoHealth Alliance, New York i Zheng-Li Shia z Wuhan Institute of Virology. Projekt został rozpoczęty dnia 1 czerwca 2014, a jego zakończenie (pomimo wywołanej pandemii, a może właśnie dlatego) planowane jest na 30 czerwca 2025.
Projekt ten finansują agencje rządowe USA (NIH - National Institutes of Health, poprzez NIAID, kierowany przez Anthony'ego Fauci) i Chin (NSFC - National Natural Science Foundation of China), a jego koszt po stronie USA wyniósł nie mniej, niż USD 3.748.715, zgodnie z przedstawioną poniżej oficjalną informacją o finansowaniu (Award Information).
Nie uwzględnione są tutaj finansowania Wuhańskiego Instytutu Wirusologii (WIV) przez inne instytucje rządowe USA, na przykład przez podlegającą Departmentowi Stanu U.S. Agency for International Development (USAID). W jeszcze większym zakresie WIV finansowany był pośrednio - poprzez EcoHealth Alliance (EHA), z funduszów amerykańskiego Department of Defense (Pentagon). Jak poinformował 4 czerwca 2021 Richard H. Ebright, biolog molekularny, profesor chemii i biologii chemicznej na Uniwersytecie Rutgers w New Jersey, oraz dyrektor laboratorium w Waksman Institute of Microbiology, Pentagon przekazał w latach 2013-2020 do EHA kwotę około 39 milionów dolarów na badania broni biologicznej. Łącznie organizacja Petera Daszaka otrzymała z państwowych źródeł około 123 miliony dolarów.
Pomimo ujawniania coraz większej ilości dokumentów oraz publikacji kolejnych artykułów naukowych, podważających przyjęte oficjalne stanowisko WHO, Chin i USA o "naturalnym" pochodzeniu koronawirusa, wywołującego chorobę Covid-19, władze medyczne USA postanowiły z dniem 8 lipca 2020 wznowić finansowanie powyższego projektu, zgodnie z listem Ministerstwa Zdrowia USA (Department of Health & Human Services) z tego dnia, w którym ministerstwo to pisze:
"W nawiązaniu do mojego poprzedniego pisma z dnia 24 kwietnia 2020 r. piszę, aby poinformować, że National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), instytut w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), podlegający Ministerstwu Zdrowia i Opieki Społecznej (HHS), wycofał swoje zakończenie grantu R01AI110964, który wspiera projekt "Zrozumienie ryzyka pojawienia się koronawirusa nietoperzy". W związku z tym dotacja ta zostaje przywrócona".
Strona amerykańska w podsumowaniu Award Information przedstawiła następujące uzasadnienie projektu.
Cytat:
Nowe odzwierzęce, pochodzące od nietoperzy, koronawirusy (CoV) stanowią poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia i bezpieczeństwa żywnościowego, jako przyczyna epidemii SARS w Chinach w 2002 roku, trwającego wybuchu epidemii MERS oraz nowo powstałego Zespołu Świńskiej Ostrej Biegunki w Chinach. W poprzednim projekcie R01 stwierdziliśmy, że nietoperze w południowych Chinach mają niezwykłą różnorodność SARSr-CoV, z których niektóre mogą wykorzystywać ludzkie ACE2 do wnikania do komórek, infekowania humanizowanych modeli myszy wywołujących choroby podobne do SARS i zdolnych do unikania dostępnych terapii lub szczepionek.
Odkryliśmy, że ludzie żyjący w pobliżu siedlisk nietoperzy są głównymi grupami ryzyka rozprzestrzeniania się, że w jednym miejscu istnieją różne SARSr-CoV, które zawierają każdy element genetyczny genomu SARS-CoV, oraz zidentyfikowaliśmy serologiczne dowody narażenia człowieka wśród ludzi żyjących w pobliżu. Odkrycia te doprowadziły do opublikowania 18 artykułów, które zostały zrecenzowane, w tym dwóch artykułów w „Nature” i przeglądu w czasopiśmie „Cell”.
Pozostają jednak najistotniejsze pytania dotyczące pochodzenia, różnorodności, zdolności do wywoływania chorób i ryzyka rozprzestrzeniania się tych wirusów. W tym odnowieniu projektu R01 zajmiemy się tymi kwestiami poprzez 3 konkretne cele:
Cel 1. Scharakteryzowanie różnorodności i dystrybucji SARSr-CoV o wysokim ryzyku rozprzestrzeniania się u nietoperzy w południowych Chinach. Wykorzystamy analizy filologiczne i analizy krzywej wykrywania wirusów, aby ukierunkować się na dodatkowe pobranie próbek nietoperzy i molekularne badania przesiewowe CoV, aby wypełnić luki w naszym poprzednim pobieraniu próbek i w pełni scharakteryzować naturalną różnorodność SARSr-CoV w południowych Chinach. Zsekwencjonujemy domeny wiążące receptor (białka kolca), aby zidentyfikować wirusy o największym potencjale rozprzestrzeniania się, które uwzględnimy w naszych badaniach eksperymentalnych (Cel 3).
Cel 2. Nadzór nad syndromami środowiskowymi i klinicznymi w celu wychwycenia rozprzestrzeniania się SARSr-CoV, dróg narażenia i potencjalnych konsekwencji dla zdrowia publicznego. Będziemy prowadzić nadzór biologiczno-behawioralny w populacjach wysokiego ryzyka, z rozpoznanym kontaktem z nietoperzami, w warunkach środowiskowych i klinicznych, aby 1) zidentyfikować czynniki ryzyka dla dowodów serologicznych i PCR nietoperzowych wirusów SARSr-CoV; oraz 2) ocenić możliwe skutki zdrowotne zakażenia SARSr-CoV u ludzi. Przeanalizujemy serologię nietoperzowych koronawirusów pod kątem kontaktu z ludźmi i danych dotyczących ich narażenia, aby określić ilościowo czynniki ryzyka i wpływu na zdrowie z powodu rozprzestrzeniania się SARSr-CoV.
Cel 3. Charakterystyka ryzyka rozprzestrzeniania się SARSr-CoV in vitro i in vivo, w połączeniu z analizami przestrzennymi i filogenetycznymi, w celu zidentyfikowania regionów i wirusów stanowiących zagrożenie dla zdrowia publicznego. Wykorzystamy dane dotyczące sekwencji białka S, technologię klonów zakaźnych, eksperymenty z infekcjami in vitro oraz in vivo oraz analizę wiązania receptora, aby przetestować hipotezę, że procentowe progi dywergencji w sekwencjach białka S wyznaczają potencjał rozprzestrzeniania się epidemii. Połączymy te dane z rozmieszczeniem nietoperzowych żywicieli, różnorodnością wirusów i filogenezą, z badaniem ludzkich zachowań ryzykownych i chorób wśród ludzi oraz serologią, aby zidentyfikować ogniska ryzyka rozprzestrzeniania się SARSr-CoV w południowych Chinach.
Razem te dane i analizy będą miały kluczowe znaczenie dla przyszłego rozwoju interwencji w zakresie zdrowia publicznego i wzmocnionego nadzoru, aby zapobiec ponownemu pojawieniu się SARS lub pojawieniu się nowego SARSr-CoV.
Koniec cytatu.
Należy zwrócić uwagę na fakt być może najważniejszy - powyższy artykuł, autorstwa Zheng-Li Shia z zespołem chińskim i Petera Daszaka z USA, finansowany przez rząd USA za pośrednictwem Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), kierowanym przez Antoniego Fauci, de facto udokumentował labolatoryjne stworzenie wirusa podobnego do SARS, z wmontowanym dodatkowym białkiem, które hamuje wytwarzanie przez organizm interferonu, niezbędnego do walki z wirusami. To dlatego cechą obecnej choroby Covid-19 jest większa na nią odporność wśród młodych ludzi, bowiem młode organizmy wytwarzają większe ilości interferonu (uwalniającego się przez komórki ciała w odpowiedzi na obecność patogenów), niż osoby starsze i są przez to generalnie mniej dotknięci skutkami zakażenia koronawirusem.
